水素を高生産する嫌気性細菌のゲノム編集によるバイオリファイナリーへの応用

高产氢厌氧菌基因组编辑在生物炼制中的应用

• 批准号: 21K12307
• 负责人: 木村 哲哉
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Mie University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K12307/
• 关键词: ピルビン酸ギ酸リアーゼ; ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ; Clostridium; Ruminiclostridium; 糖質加水分解酵素ファミリー; キチナーゼ; バイオリファイナリー; 嫌気性細菌; 水素ガス; バイオマス

海洋バイオマスであるキチンを分解し水素ガスを高生産するClostridium paraputrificumと植物バイオマスを分解するRuminiclostridium josuiをゲノム編集技術によって水素ガスやアルコール、酪酸生産に最適化した株を育種し高機能化することを究極の目的とした。分子育種を行うには、上記2株の完全長ゲノム配列の解析が必要である。そこで、これらのゲノム配列を詳細に解析した。R.josuiはすでにJGIによってドラフトゲノムが公開されているが、今回の解析で4,430,823塩基の完全長配列を決定し配列を解析した結果、糖質加水分解酵素遺伝子が160個以上見つかった。またゲノム配列をもとにして代謝関連遺伝子について詳細に調べた結果、アルコール生産系の遺伝子は存在するが、酪酸生産系の遺伝子は存在しないことが明らかとなった。一方、C.paraputrificumは3,509,596塩基の完全長配列から、エタノールや酪酸合成に関わる遺伝子の存在を明らかにし、キチン分解酵素遺伝子も10個存在することが分かった。有機酸やアルコール生産に関わる代謝系遺伝子を解析し、これらの発現をリアルタイムPCR法で調べた。水素生産とアルコール生産に関わる重要なステップとなるピルビン酸からアセチルCoAへの代謝経路において代謝系が2種類存在し、そのうちピルビン酸からギ酸とアセチルCoAを生じる酵素であるピルビン酸リアーゼの活性化酵素遺伝子（PFLA）についてClosTron法によるゲノム編集で遺伝子を破壊したところ、グルコースを炭素源とする培地では水素ガスの生産が増加することが分かった。PFLと並行して存在するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（PFO）の経路へ代謝の流れが集中し、その結果としてPFOから水素ガス生産につながる系で水素ガスが増産されたと考えられる。

最终的目标是繁殖和增强梭菌梭菌的功能，该梭菌分解了几丁质，海洋生物量和Ruminiclostridium josui，该植物分解了植物生物量和天才编辑技术，以增强对氢气，酒精，酒精和酸酸的菌株的生产。为了进行分子育种，必须分析上面两个菌株的全长基因组序列。因此，对这些基因组序列进行了详细分析。 JGI已发表了乔苏（R. josui）的基因组草案，但是在此分析中，确定了4,430,823个碱基的全长序列并分析了序列，并发现了160多个碳水化合物水解酶基因。此外，基于基因组序列对代谢相关的基因的详细研究表明，有一些基因会产生酒精，但没有产生丁酸酯的基因。另一方面，副三链球菌揭示了其全长序列的3,509,596碱基的乙醇和丁酸合成中涉及的基因，并且发现有10个几丁质降解酶基因。分析了参与有机酸的代谢基因，并使用实时PCR检查了其表达。从丙酮酸到乙酰辅酶A的代谢途径中有两种类型的代谢系统，这是氢生产和酒精生产的重要一步。当使用丙酮酸裂解酸酯裂解酶（一种产生甲酸盐和乙酰辅酶A的酶）的基因组编辑破坏基因时，发现氢气的产量在葡萄糖作为碳源的培养基中增加。人们认为，与PFL并行存在的丙酮酸铁蛋白氧化还原酶（PFO）的代谢流集中在丙酮酸氧化氧合氧化还原酶（PFO）的途径中，因此，在导致PFO产生氢气的系统中增加了氢气。

项目成果

Clostridium paraputrificumのピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子の解析と水素ガス生産への応用

副腐败梭菌丙酮酸甲酸裂解酶基因分析及其在产氢气中的应用

• 发表时间: 2022
• 作者: 西村 しおり;竹内 束沙;國武 絵美;木村 哲哉
• 通讯作者: 木村 哲哉