冷凍保存可能な花粉を活用した新奇ゲノム編集技術の開発

利用冷冻花粉开发新型基因组编辑技术

基本信息

批准号：
21K19115
负责人：
吉田健太郎
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

パールミレットは、多くの穂を作り、それぞの穂から大量の花粉を取ることができる。さらに、花粉は、乾燥・凍結耐性能をもち、-80度で保存することができる。また、ムギ類との亜科間交雑をした場合、パールミレットの染色体が選択的に脱落することから、ムギ類の倍加半数体を作成することも可能である。本研究では、パールミレットのこの特性を活かし、亜科間交雑による染色体脱落現象を利用した倍加半数体技術とゲノム編集技術を融合し形質転換体の作出が困難なコムギでゲノム編集を1世代で可能にする新しい技術を開発することを目的とする。本年度は、アグロバクテリウムを利用したパールミレットの安定形質転換技術の確立を試みた。MS培地におけるスクロース、カルス化を誘導する2,4-Dの濃度を調節することにより、未熟種子だけでなく、完熟種子からでも再分化能を持つ白いカルスを得ることができることを確認した。また、カルスへのアグロバクテリウム形質転換を試みた。緑色蛍光タンパク質GFP遺伝子の導入によって、カルスの一部にGFP蛍光を検出した。しかし、まだパールミレットの安定形質転換を作出するには至っていない。安定形質転換を用いずに、直接、花粉にゲノム編集に必要なタンパク質（CAS9）と核酸（gRNA）を導入する試験もした。まず、花粉の卵細胞へのデリバリー試薬を検討した。その結果、パールミレットの花粉は、有機溶媒や、リポフェクション試薬に耐性があり、試薬中に花粉管を伸長することができることを確認した。

珍珠小米可以使很多耳朵从每只耳朵中清除大量的花粉。此外，花粉具有干燥和冻结的耐药性，并且可以保持-80度。此外，在与小麦交叉时，珍珠小米染色体在与小麦交叉时有选择地掉落，从而可以产生双倍的小麦双倍体。这项研究旨在利用珍珠小米的这种特性来开发一种新技术，该技术结合了双倍技术和基因组编辑技术，利用亚家族交叉杂交引起的染色体脱落现象，并允许在小麦中进行基因组编辑，在很难产生转化剂的地方。今年，我们试图使用农杆菌为珍珠小米建立稳定的转型技术。通过调节在MS培养基中诱导蔗糖和呼尾的2,4-D浓度，我们确认具有重新分化能力的白色愈伤组织不仅可以从未成熟的种子中，而且还可以从完全成熟的种子中获得。此外，尝试将农杆菌转化为愈伤组织。通过引入绿色荧光蛋白GFP基因，在Callus的一部分中检测到GFP荧光。但是，尚不可能产生珍珠小米的稳定转化。我们还测试了基因组直接编辑花粉所需的蛋白质（Cas9）和核酸（GRNA）的引入，而无需使用稳定的转化。首先，我们研究了花粉对卵细胞的递送试剂。结果，已经证实，珍珠小米的花粉对有机溶剂和脂肪触发试剂具有抗性，并且在试剂期间可以延长花粉管。