特定臓器の分子時計を標的かつ遠隔に操作する技術の開発と応用

目标和远程操纵特定器官分子钟的技术的开发和应用

基本信息

批准号：
21K18249
负责人：
大戸茂弘
金额：
$ 16.22万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K18249/
关键词：
分子時計微弱電流刺激遠隔操作標的臓器

项目摘要

実験１in vitroにおけるマイクロ電流刺激（MCS）によるリズム操作:培養細胞として、C57BL/6J雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトを、常法に従って継代培養し、各試験に用いた。微弱電流刺激装置の電極を用いて一定時間電気刺激を行った。時計遺伝子の発現量に及ぼすMCSの影響について、各遺伝子のmRNA発現量およびタンパク質量を測定した。その結果MCSによりPer1の転写活性が促進した。そこでPer1プロモーター領域を解析した結果、カルシウムイオンやcAMP等の刺激により活性化する転写因子cAMP response element binding protein（CREB）の応答配列CREが存在することを確認した。次に、MCSによるPer1遺伝子の転写活性化の機構を解明するためにPer1遺伝子のCRE応答配列を含むプロモーター配列とCRE応答配列を含まないプロモーター配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだベクターをアストロサイトにトランスフェクションし、MCS後のルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、MCSはPer1遺伝子のプロモーター領域に存在するCRE応答配列を介して転写を促進することを明らかにした。CREBによる転写活性には、CREBタンパク質のリン酸化が重要である。そこで、MCS後のCREBタンパク質のリン酸化を測定した。その結果、MCSの刺激によりCREBタンパク質のリン酸化が促進した。次に、CREBのリン酸化酵素Protein kinase A（PKA）の阻害剤H89を用いた。その結果、MCSによるCREBタンパク質のリン酸化とPer1遺伝子の増加は抑制された。以上の結果よりMCSはCREBタンパク質のリン酸化の活性化を介して、Per1遺伝子の発現を増加することを明らかにした。

实验1 Inn通过微电流刺激（MCS）的体外节律操作：作为培养细胞，使用雄性野生型小鼠的C57BL/6J衍生的星形胶质细胞用于每种测试，并用于每次测试。使用弱电流刺激的电极进行一段时间的电刺激。通过每个基因的mRNA表达和蛋白质质量测量了MC对时钟基因表达的影响。结果，MC促进了PER1转移活性。由于分析了PER1启动子区域，因此可以证实，转录因子cAMP响应元件结合蛋白（CREB）有一个响应序列CRE，该蛋白（CREB）被钙离子和cAMP等刺激激活。接下来，为了阐明MC的转录激活机制，MCS是一个载有per1基因的CRE响应阵列的启动子序列和在星形胶质中掺入荧光素酶基因的CRE响应阵列的载体测量MCS后测量和荧光素酶活性。结果，MC表示，它将通过PER1基因启动子区域中的CRE响应阵列促进转移。对于通过CREB转移活性，CREB蛋白的磷酸化很重要。因此，测量了MCS后CREB蛋白的磷酸化。结果，MCS刺激促进了CREB蛋白的磷酸化。接下来，使用了CREB磷酸化酶蛋白激酶A（PKA）的抑制剂H89。结果，MCS对CREB蛋白的磷酸化和PER1基因的增加被抑制。从上述结果中，MCS通过激活CREB蛋白的磷酸化来增加PER1基因的表达。