ペルオキシンリサイクル複合体の構造と制御機構の解明

阐明过氧化物回收复合物的结构和控制机制

基本信息

批准号：
22K06125
负责人：
潘東青
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06125/
关键词：
ペルオキシソームタンパク質輸送 AAA-ATPase Cryo-EM 構造解析タンパク質

项目摘要

リサイクル複合体は、AAA-ATPaseである3つのPex1pと3つのPex6pからなるPex1p:Pex6p複合体とC末アンカー型の膜タンパク質Pex15pによって形成される大きな膜タンパク質複合体である。本研究では、リサイクル複合体（Pex1p:Pex6p:Pex15p）についてその構造と機能の解明を目指した。高純度に精製したPex1p:Pex6p複合体と、蛍光タンパク質のmEosタグを融合させた擬似基質タンパク質を試験管内で混合し、mEosタグの吸光や蛍光が消失することを指標として基質タンパク質のアンフォールディングを確かめるアッセイ系を構築した。このアッセイ系を用いて、精製したリサイクル複合体の活性を確かめることができた。再構成したリサイクル複合体を用いてCryo電子顕微鏡による単粒子解析に取り組み、3オングストロームの分解能の密度マップを再構成することができた。得られた密度マップをもとに、３つのPex1p、３つのPex6p、そして３つのPex15pが集合した700 kDaを超える九量体の分子モデルを構築することができた。Pex1pとPex6pは１つおきに結合した六量体のリング構造を形成し、ATPase-likeドメインのD1リングは3回回転対称を持つ構造であったが、ATPaseドメインのD2リングは螺旋状の構造をしており、基質タンパク質のアンフォールディング過程を理解する上で、示唆に富む構造をしていた。Pex15pは主にPex6pと結合していた。また、化学架橋と質量分析を組み合わせたCross-linking MS法により、リサイクル複合体の化学架橋解析を行ったところ、Cryo-EM法で構築した分子モデルと化学架橋解析の結果が一致していたため、モデルの正確性を検証することができた。

再生复合物是由AAA-ATPase PEX1P：PEX6P复合物形成的大型膜蛋白复合物，由三个PEX1P和三个PEX6P和C端锚固膜蛋白PEX15P组成。在这项研究中，我们旨在阐明再生复合物的结构和功能（PEX1P：PEX6P：PEX15P）。将模拟的底物蛋白与高度纯化的PEX1P：PEX6P复合物与荧光蛋白的MEOS标签融合在一起的测试管中，并构建了一个测定系统，以确认使用Meos标签的吸收和荧光标签的消失作为指示器，以确认底物蛋白的展开。该测定系统用于确定纯化的再生复合物的活性。使用重建的再生复合物，我们能够使用冷冻电子显微镜进行单个颗粒分析，并重建3个分辨率的3埃脉冲的密度图。基于获得的密度图，我们能够构建一个高于700 kDa的Ninemers的分子模型，其中三个PEX1P，三个PEX6P和三个PEX15P组合在一起。 PEX1P和PEX6P每隔一次结合一个六聚体环结构，而ATPase样域的D1环具有三倍的旋转对称性，而ATPase域的D2环具有螺旋结构，并且是理解底物蛋白展开过程的非常有启发性的结构。 PEX15P主要与PEX6P合并。此外，当使用交联的MS方法对回收复合物进行化学交联分析（结合化学交联和质谱法）时，化学交联分析的结果与Cryo-EM方法构建的分子模型一致，从而使我们能够验证模型的准确性。