Development of a large-scale screening technology platform for the discovery of antagonistic microorganisms of pathogenic bacteria.

开发病原菌拮抗微生物大规模筛选技术平台。

• 批准号: 22K04850
• 负责人: 奈良 恵
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K04850/
• 关键词: 拮抗微生物; ミリオンスクリーニング; 微小液滴技術; 青枯病菌; 応用微生物学; 植物病理学

本研究は、微小液滴技術を用いて植物の土壌病害菌の拮抗微生物を土壌中からハイスループットに単離する大規模スクリーニング技術の開発を目的として、以下の実験を行った。まず、青枯病菌GFP標識株（8107-GFP株）の生育培地をさまざまな組成や培養条件で検討した結果、mGAM培地を9種類の市販培地から選抜した。mGAM培地は培地の粘度が高いため、マイクロ流路におけるオイルとサンプルの送液圧力を水で作成する時よりも下げて微小液滴を作成した。8107-GFP株の微小液滴での培養条件は、封入菌体数は8細胞、培養日数は3日間、培養温度は25度とした。次にモデル実験系を構築するために、モデル拮抗微生物を理化学研究所BRCの土壌から単離した。このモデル拮抗微生物#3-8A株は、プレート上での対峙培養を行うと、8107-GFP株に対してハローを形成し、生育を強く阻害することがわかった。この#3-8A株を、微小液滴内に8107-GFP株と共封入すると、#3-8A株の封入された液滴を増やすと8107-GFP株由来のGFP蛍光を発する液滴数が少なくなった。申請後に発売された微小液滴選抜・分注装置であるOnchip-Selectorを年度途中で購入できたため、Onchip-Selectorを用いてGFP由来の蛍光が減衰した液滴を分取したところ、その液滴から培養した微生物はGFP蛍光を持たず、8107-GFP株に対してハローを形成し、生育を強く阻害したことから、#3-8A株であることが推測された。このことから、GFP蛍光強度を標識とした拮抗微生物スクリーニングが可能であることがわかり、モデル実験系の構築に成功した。現在この実験系を用いて、土壌よりミリオンスクリーニングを行い、拮抗微生物候補株として15属1211株の取得に成功している。

在本研究中，我们进行了以下实验，旨在开发一种利用微滴技术从土壤中高通量分离植物土壤病原体拮抗微生物的大规模筛选技术。首先，我们使用不同的成分和培养条件研究了 GFP 标记的枯萎病菌株（8107-GFP 菌株）的生长培养基，结果，我们从 9 种市售培养基中选择了 mGAM 培养基。由于mGAM介质具有高粘度，因此在微通道中输送油和样品的压力比使用水产生微滴时的压力低。微滴中8107-GFP菌株的培养条件为：包膜菌细胞数为8个，培养天数为3天，培养温度为25度。接下来，为了构建模型实验系统，从RIKEN BRC的土壤中分离了模型拮抗微生物。发现这种模型拮抗微生物#3-8A菌株对8107-GFP菌株形成光环，并在平板上培养时强烈抑制其生长。当该 #3-8A 菌株与 8107-GFP 菌株共同封装在微滴中时，增加用 #3-8A 菌株封装的液滴数量会增加发射来自 8107-GFP 菌株的 GFP 荧光的液滴数量。已经变少了。由于我能够购买 Onchip-Selector（一种在申请后发布的微滴选择和分配设备），在本财年中，我使用 Onchip-Selector 分离了从 8107- 培养的带有减弱 GFP 荧光的微生物。 GFP菌株不具有GFP荧光，并在8107-GFP菌株周围形成光环，强烈抑制其生长，因此推测其为#3-8A菌株。由此，我们发现利用GFP荧光强度作为标记来筛选拮抗微生物是可能的，并成功构建了模型实验系统。目前，利用该实验系统，我们已对土壤样品进行了百万次筛选，成功获得了15属1211株菌株作为拮抗微生物候选菌株。

项目成果

有用微生物のスクリーニング方法

有用微生物的筛选方法

• 发表时间: 2023