官能基転移性人工核酸を用いた天然RNAのラベル化および編集法への展開

使用转功能人工核酸开发天然RNA标记和编辑方法

• 批准号: 11J04012
• 负责人: 鬼塚 和光
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J04012/
• 关键词: RNA編集; ADAR; 二本鎖RNA; クリックケミストリー; siRNA; RNA修飾; mRNA; RNA; ラベル化; DNA修復; NEIL1; チミジングリコール; プローブ

本研究課題では(1)RNA編集の機能解明、(2)天然RNAの部位特異的修飾を目標に研究を行った。2年目である本年度は、前半はカリフォルニア大学デービス校Peter Beal教授の下で(1)に関連するADAR(adenosine deaminase acting on RNA)によるRNA編集反応の研究を、後半は(2)に関する官能基転移性人工核酸を用いたmRNAの部位特異的修飾の研究を行った。アメリカではDNA修復酵素NEIL1とRNA編集反応の関係に関する研究を一つ目の研究として行い、一年目に化学合成したDNAプローブを用いてその関係性について調査し、その成果をChemBioChem誌に報告した。二年目は主に、二本鎖RNAとADARとの安定な複合体を得ることを目指し、チオール反応性官能基をもつRNAプローブの合成を行った。1-ethynyl riboseを含むRNAを合成し、クリックケミストリーにより様々な長さのリンカーを持つチオール反応性官能基をRNAに挿入した。このチオール反応性基を持つRNAとADAR2とのクロスリンク反応を様々な条件で検討した。しかしながら、滞在期間中に高効率なRNA-AI)1田クロスリンク反応を開発することはできなかった。合成した分子はさらなる検討を共同研究者が行っている。この研究により安定な二本鎖RNA-ADAR複合体を得てX線構造解析に成功すれば、いまだ解明されていないADARのRNAに対する編集反応の選択性に関して大きな知見を与えるであろう。またこのとき合成した1-ethynyl riboseを5'末端に持つsiRNAを合成し、クリックケミストリーにより様々な修飾siRNAを合成した。現在共同研究者がアッセイを行っており、期待していた結果が得られているようである。帰国後は、mRNAの部位特異的な修飾を目指し研究を行った。ビオチンをコンジュゲートした転移性官能基を用いてmRNAの修飾を検討したところ、ルシフェラーゼのmRNAに対して部位特異的に修飾反応が進行することを見出した。この結果から、この反応は天然mRNAのラベル化法として非常に有用であることが示された。

在这个研究项目中，我们进行研究的目的是（1）阐明RNA编辑的功能和（2）天然RNA的位点特异性修饰。今年，也就是我们的第二年，上半年在加州大学戴维斯分校的Peter Beal教授的指导下，研究了与(1)相关的ADAR（作用于RNA的腺苷脱氨酶）的RNA编辑反应，下半年大约是与(2)相关的功能组我们使用可转移的人工核酸进行了mRNA的位点特异性修饰的研究。在美国，我们的第一项研究是对DNA修复酶NEIL1和RNA编辑反应之间的关系进行研究，第一年我们使用化学合成的DNA探针研究了这种关系，并将结果发表在《ChemBioChem》杂志上。 。第二年，我们主要合成带有硫醇反应官能团的RNA探针，旨在获得双链RNA与ADAR之间的稳定复合物。合成含有 1-乙炔基核糖的 RNA，并使用点击化学将具有不同长度接头的硫醇反应性官能团插入到 RNA 中。我们研究了 ADAR2 和 RNA 之间在各种条件下与该硫醇反应基团的交联反应。然而，我们在逗留期间无法开发出高效的 RNA-AI)1ta 交联反应。联合研究人员正在进一步研究合成的分子。如果通过这项研究获得稳定的双链RNA-ADAR复合物，并且X射线结构分析成功，将提供有关ADAR对RNA的编辑反应的选择性的重要知识，而这一点尚未阐明。我们还合成了在5'端合成了1-乙炔基核糖的siRNA，并使用点击化学合成了各种修饰的siRNA。合作者目前正在进行检测，似乎正在获得预期的结果。回到日本后，他进行了针对mRNA位点特异性修饰的研究。当我们使用生物素缀合的可转移官能团研究 mRNA 的修饰时，我们发现修饰反应在荧光素酶 mRNA 上进行位点特异性。这些结果表明该反应作为标记天然mRNA的方法非常有用。

项目成果

Oligonucleotide containing S-functionalized 2'-deoxy-6-thioguanosine : Facile tools for base-selective and site specific internal modification of RNA

含有 S-功能化 2-脱氧-6-硫鸟苷的寡核苷酸：用于 RNA 碱基选择性和位点特异性内部修饰的简便工具

• DOI: 10.1002/0471142700.nc0449s48
• 发表时间: 2012
• 作者: Shigeki Sasaki; Kazumitsu Onizuka; Yosuke Taniguchi
• 通讯作者: Yosuke Taniguchi

The oligodeoxynucleotide probes for the site-specific modification of RNA

用于RNA位点特异性修饰的寡脱氧核苷酸探针

• DOI: 10.1039/c1cs15066a
• 发表时间: 2011
• 影响因子: 46.2
• 作者: Shigeki Sasaki; Kazumitsu Onizuka; Yosuke Taniguchi
• 通讯作者: Yosuke Taniguchi

An efficient and simple method for site-selective modification of O^6-methyl-2'-deoxyguanosine in DNA

一种高效、简单的 DNA 中 O^6-甲基-2-脱氧鸟苷位点选择性修饰方法

• DOI: 10.1039/c2cc17621a
• 发表时间: 2012
• 作者: Kazumitsu Onizuka; Takamasa Nishioka; Zhichun Li; Daichi Jitsuzaki; Yosuke Taniguchi; Shigeki Sasaki
• 通讯作者: Shigeki Sasaki

チミングリコールDNAに対するNEIL1の活性・結合力とRNA編集の効果

NEIL1 活性和与胸腺嘧啶乙二醇 DNA 的结合强度以及 RNA 编辑的效果

• 发表时间: 2013
• 作者: 鬼塚和光

NEIL1 binding to DNA containing 2'-fluorothymidine glycol stereoisomers and the effect of editing

NEIL1与含有2-氟胸苷二醇立体异构体的DNA的结合及编辑效果

• DOI: 10.1002/cbic.201200139
• 发表时间: 2012-06-18
• 影响因子: 3.2
• 作者: Onizuka, Kazumitsu;Yeo, Jongchan;David, Sheila S.;Beal, Peter A.
• 通讯作者: Beal, Peter A.