三重鎖形成を基盤とした革新的ゲノムDNA分析技術の開発

开发基于三链体形成的创新基因组 DNA 分析技术

基本信息

批准号：
11J03703
负责人：
伊藤浩介
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

平成24年度は、P-S結合を有するオリゴヌクレオチドの三重鎖形成時の切断反応性に関する評価を行うとともに、二重鎖DNAのホモプリン中にシトシンが含まれる配列を認識する(C認識プローブ)に関して評価を行った。新規5'-thio型人工核酸を導入したP-S結合を有するオリゴヌクレオチドが銀イオンやヨウ素などのソフトなルイス酸の存在下、P-S結合の位置で特異的に切断可能であることがわかった。尚、このオリゴヌクレオチドは一本鎖状態と三重鎖形成時でほぼ同等の反応性を示すことがわかった。P-S結合の隣接残基に金属イオンを配位可能な置換基を導入するなどにより、三重鎖と一本鎖状態の構造の違いを反応性の違いに反映できるかについて興味が持たれる。他方、SNPの検出を可能とする新規C認識プローブについては昨年度の成果を受けて、P-N結合を有するプローブに蛍光標識を施し、SNP認識能を評価した。その結果、プリン鎖中にシトシンを二つ含んでいても三重鎖形成を介してプローブの切断反応が進行しSNPを高い選択性で認識可能であることが明らかとなった。蛍光を利用することが可能な本プローブを利用することで高感度なSNP分析法として応用可能であると考えられる。また、三重鎖形成に伴うP-N結合の切断促進メカニズムを明らかとする目的で速度論的な解析を行ったところ、三重鎖を形成したときには一本鎖状態と比較して活性化エンタルピーを半減することにより、反応が促進されていることがわかった。

2012年度，我们将评估三链体形成过程中具有P-S键的寡核苷酸的切割反应性，并评估双链DNA同型嘌呤中含有胞嘧啶的序列的识别（C识别探针）。发现引入了新的5'-硫代型人工核酸的具有P-S键的寡核苷酸可以在银离子或碘等软路易斯酸的存在下在P-S键位置特异性断裂。此外，发现该寡核苷酸在单链状态和三链体状态下表现出几乎相同的反应性。有趣的是，通过引入可以将金属离子与 P-S 键相邻的残基配位的取代基，三链和单链状态之间的结构差异是否可以反映在反应性差异上。另一方面，基于去年能够检测SNP的新型C识别探针的研究结果，我们对具有P-N键的探针应用了荧光标记，评价了其识别SNP的能力。结果表明，即使嘌呤链含有两个胞嘧啶，探针切割反应也会通过三链体形成进行，从而可以高选择性地识别SNP。认为该探针能够利用荧光，可以作为高灵敏度的SNP分析方法来应用。另外，为了明确三链体形成时促进P-N键断裂的机理，进行了动力学分析，结果发现，形成三链体时，与单链状态相比，活化焓减半。表明反应加速了。

项目成果

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专利数量（0）

Cleavage of Oligonucleotides Containing a P3'→N5' Phosphoramidate Linkage Triggered by Duplex Formation

双链体形成触发含有 P3→N5 氨基磷酸酯键的寡核苷酸的裂解

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
0
作者：
Kosuke Ramon Ito; Tetsuya Kodama; Futaba Makimura; Noritsugu Hosoki; Tomohisa Osaki; Ayako Orita; Takeshi Imanishi; Satoshi Obika
通讯作者：
Satoshi Obika

SNP detection based on self-cleavage of oligonucleotides triggered by triplex formation

基于三链体形成引发的寡核苷酸自切割的 SNP 检测

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
0
作者：
Kosuke Ramon Ito; Tetsuya Kodama; Masaharu Tomizu; Yoshinori Negoro; Ayako Orita; Takeshi Imanishi; Satoshi Obika
通讯作者：
Satoshi Obika

Cleavage of Oligonucleotides Containing a P3'→N5' Phosphoramidate Linkage Mediated by Single-Stranded Oligonucleotide Templates

单链寡核苷酸模板介导的含有 P3→N5 氨基磷酸酯键的寡核苷酸的切割