ＴＲＦ２を介したＯＲＣリクルートによるテロメア維持機構の特異的変異体を用いた解析

使用特定突变体分析 TRF2 介导的 ORC 招募的端粒维持机制

• 批准号: 18J11443
• 负责人: 比嘉 允宣
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J11443/
• 关键词: DNA複製; DNA複製開始点; 染色体安定性; ゲノム安定性; テロメア; 複製困難な領域; TRF2; ORC; ORC1

H30年度までにORCとの結合のみを欠損したTRF2 (E111A/E112A)変異体（以下、TRF2 (EE)変異体）を同定し、HeLa細胞の遺伝子編集により内在性TRF2とTRF2 (EE)変異体を置換したTRF2 (EE)株および比較対象のTRF2 (WT)株を樹立した。さらに、TRF2 (EE)株ではTRF2 (WT)株と比べ、テロメア結合ORC量が少ないことや複製ストレス存在下におけるテロメア含有微小核の数が多いことを明らかにし、TRF2-ORC結合がテロメアへのORC結合や複製ストレス存在下でのテロメア恒常性維持に重要であることを示した。R1年度の実績を以下に述べる。テロメアORC結合阻害がテロメアの複製ストレス感受性に影響するかどうかを更に明らかにするため、複製ストレス下における樹立株でのテロメア損傷度（DNA損傷応答因子53BP1と共局在するテロメアfociを10個以上含む細胞の割合として定義）を評価した。その結果、TRF2 (EE)株では0.1 mMヒドロキシウレア処理による弱い複製ストレスの誘導によりテロメア損傷度が増加した一方、TRF2 (WT)株では変化しなかった。前述の結果と同様この結果も、テロメアORC結合が複製ストレス下におけるテロメアの維持に重要であることを示唆している。ORCの代表的な機能は、MCM複合体を染色体に装着し、DNA複製開始点を形成することである。そこで、TRF2-ORC結合を介したテロメア維持機構を調べるため、テロメア結合MCM量の解析をChIP-qPCR法などにより進めた。その結果、TRF2 (EE)株ではテロメアへのMCM装着量が低下傾向にあることが示された。これまでの結果を総合し、TRF2-ORC結合を介して複製ストレス存在下で利用される予備のDNA複製開始点が形成されることがテロメア恒常性維持に重要であると考えている。

到2019财年，我们已鉴定出仅与ORC结合有缺陷的TRF2（E111A/E112A）突变体（以下简称TRF2（EE）突变体），并通过HeLa基因编辑鉴定了内源性TRF2和TRF2（EE）突变体我们建立了具有替换的 TRF2 (EE) 菌株和 TRF2 (WT) 菌株进行比较。此外，我们发现，与 TRF2 (WT) 菌株相比，在复制应激存在下，TRF2 (EE) 菌株具有较低量的端粒结合 ORC 和较高数量的含端粒微核，这表明 TRF2-ORC 与我们表明，它对于 ORC 结合和在复制应激存在下维持端粒稳态非常重要。 R1 年的结果描述如下。为了进一步阐明抑制端粒 ORC 结合是否会影响端粒复制应激敏感性，我们研究了复制应激下已建立菌株的端粒损伤程度（超过 10 个与 DNA 损伤反应因子 53BP1 共定位的端粒灶）（定义为细胞的百分比）。含有细胞）进行了评估。结果，在TRF2（EE）菌株中，由于用0.1mM羟基脲处理诱导弱复制应激，端粒损伤程度增加，而在TRF2（WT）菌株中，没有变化。与之前的结果类似，这一结果表明端粒 ORC 结合对于复制应激下端粒的维持很重要。 ORC的典型功能是将MCM复合物附着在染色体上，形成DNA复制起点。因此，为了研究TRF2-ORC结合介导的端粒维持机制，我们利用ChIP-qPCR等方法对端粒结合的MCM量进行了分析。结果表明，TRF2（EE）菌株中附着在端粒上的MCM量呈减少趋势。综合我们所有的结果，我们相信，通过 TRF2-ORC 结合在存在复制应激的情况下利用备用 DNA 复制起点的形成对于维持端粒稳态非常重要。

项目成果

ORC recruitment by TRF2 contributes to telomere stability upon DNA replication stress

TRF2 招募 ORC 有助于 DNA 复制应激时端粒的稳定性

• 发表时间: 2019
• 作者: Chao Tang;Yohei Sato;Tadao Tanabe;Yutaka Oyama;佐藤陽平;佐藤陽平;佐藤陽平;Yohei Sato;Yohei Sato;佐藤陽平;佐藤陽平;Yohei Sato;佐藤陽平;佐藤陽平;Yohei Sato;佐藤陽平;Yohei Sato;Yohei Sato;大野恵理;Ono Eri;Ono Eri;大野恵理;大野恵理;Mitsunori Higa
• 通讯作者: Mitsunori Higa

ORC1フラグメントによる競合阻害を用いたテロメア複製におけるTRF2-ORC1結合の生物学的意義の解明

利用 ORC1 片段的竞争性抑制阐明 TRF2-ORC1 结合在端粒复制中的生物学意义

• 发表时间: 2019
• 作者: Chao Tang;Yohei Sato;Tadao Tanabe;Yutaka Oyama;佐藤陽平;佐藤陽平;佐藤陽平;Yohei Sato;Yohei Sato;佐藤陽平;佐藤陽平;Yohei Sato;佐藤陽平;佐藤陽平;Yohei Sato;佐藤陽平;Yohei Sato;Yohei Sato;大野恵理;Ono Eri;Ono Eri;大野恵理;大野恵理;Mitsunori Higa;比嘉允宣;松田侑大
• 通讯作者: 松田侑大