Method development of phycobiliprotein for quantification of biological nitrogen fixation

藻胆蛋白生物固氮定量方法的开发

• 批准号: 18J01822
• 负责人: 伊左治 雄太
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J01822/
• 关键词: フィコビリタンパク質; シアノバクテリア; ヘム; 炭素同位体比; 窒素同位体比

本年度前半は、諏訪湖で採取したアオコを用いて、シアノバクテリアからフィコビリタンパク質を効率的に抽出する手法を検討した。検討した様々な条件の中で、凍結乾燥したシアノバクテリアを水で抽出する方法が最も簡便で効率が良いことが明らかになった。また、フィコビリン生合成系においてヘムはフィコビリンの上流に存在し、閉環テトラピロールであるヘムが開裂することで開環テトラピロールであるフィコビリンが合成される。したがって、ヘムのδ13C・δ15Nはフィコビリンのδ13C・δ15Nの規定要因を解明する上で有用なデータとなる。本年度前半は、生体中の主要なヘムであるヘムbの定量法および化合物レベルのδ13C・δ15N分析のための精製法に取り組んだ。夾雑物が大半を占める天然試料中に僅かに含まれるヘムbを定量・精製するために湿式分析と高速液体クロマトグラフィー法を組み合わせ、様々な分析条件の元で化合物の回収率や精製度を確認することで、分析法をほぼ確立することに成功した。確立した手法を用いて、いくつかの試料についてヘムb濃度の定量やδ13C・δ15N分析を行っている。各試料から精製したヘムbのC/N比は理論値と近い値を取っており、ヘムbを化合物レベルで精製できていることを確認できた。δ13C・δ15Nのデータは現段階で解釈することはできないが、今後培養した生物の分析を行うことでフィコビリンのδ13C・δ15Nの規定要因を解明に繋がるようなデータを得ることができるはずである。定量については海水中の粒子状物質・溶存態物質を対象に分析を行っており、ヘムbが前者には0.27 nMと高濃度で含まれているのに対し、後者にはおよそ6 pMと僅かにしか含まれていないことを見出している。このように特徴的なヘムの分布が海洋鉄循環においてどのような意味を持つのかについても今後検討・検証していく予定である。

在今年上半年，我们研究了一种使用从Suwa湖收获的蓝浆果从蓝细菌中有效提取植物蛋白的方法。在研究的各种条件中，已经揭示了用水提取冻干蓝细菌的方法是最方便，最有效的。此外，在植物蛋白生物合成系统中，血红素存在于植物蛋白的上游，而当血红素是一种环链的四吡咯烷时，将裂解时，旋转的四翼甲旋转时，是合成的。因此，血红素的Δ13C和δ15N是阐明phycovirin的Δ13C和Δ15N的决定因素的有用数据。在今年上半年，我们研究了确定血红素B，生物体的主要血红素的定量方法，以及在化合物水平上分析Δ13C和Δ15N的纯化方法。我们通过结合湿分析和高性能液相色谱法成功建立了一种分析方法，以定量和纯化血红素B，该方法包含在大多数是杂质的天然样品中，并检查各种分析条件下该化合物的回收率和纯化程度。使用已建立的技术，在几个样品上对血红素B浓度的定量和Δ13C和Δ15N的分析。从每个样品中纯化的血红素B的C/N比与理论值接近，并且可以证实血红素B可以在化合物水平上纯化。尽管在此阶段无法解释Δ13C和Δ15N的数据，但对将来培养的生物体的分析应使我们能够获得有助于阐明phycobilin的Δ13C和δ15N的决定因素。为了进行定量，我们已经分析了颗粒物和溶解的物质，并发现血红素B的高浓度为0.27 nm，而后者仅包含大约6 pm的少量浓度。我们还将在将来考虑和验证血红素在海洋铁循环中的特征分布。