Identification and analysis of novel signaling molecules regulating AM symbiotic pathway via D14 family genes

通过D14家族基因调控AM共生途径的新型信号分子的鉴定和分析

基本信息

批准号：
18J00182
负责人：
亀岡啓
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Tohoku University (2020)Osaka Prefecture University (2018-2019)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究はD14L/KAI2経路ではたらきAM菌共生を制御する新規植物ホルモン(KAI2 ligand; KL)・AM菌由来シグナル分子(Myc-factor for KAI2 pathway; Myc-K)の単離を目標としている。①シグナル分子単離のためのアッセイ系の確立と精製、②D14l2a, D14l2bの機能解析に加えて、①が困難だった場合のバックアッププランとして③ D14L/KAI2経路ではたらく転写因子のスクリーニングを計画していた。③の実験は初年度で完了し、①が順調なため③の実験は行わなかった。そのため、本年度は①の実験のみ行った。昨年度までにKLによって発現誘導されるミヤコグサDLK2の発現をqPCRで定量することによってKL活性を検出するアッセイ系を確立した。また、イネの種子に高いKL活性があることを発見し、イネ種子抽出物の精製を進めていた。本年度は、このアッセイ系に直接逆転写法という技術を導入することに成功した。直接逆転写法は龍谷大学の永野准教授らが開発した手法で、精製したRNAではなく植物破砕液を直接cDNA合成に用いることができる。これにより、アッセイの効率が大幅に改善された。また、イネ種子抽出物の順相・逆相のオープンカラム、HPLCによる精製条件を最適化し、高い活性を保ったまま抽出物を精製できる条件を見出した。化合物の単離には至らなかったものの、精製条件検討の過程で、抽出物だけでなく滲出物にもKLが含まれること、KLは単一の化合物ではなく複数の化合物がKL活性をもつこと、それらの化合物の中には中性物質と酸性物質が少なくとも１つずつ含まれることなど、これまで明らかになっていなかったKLの化合物としての性質を明らかにした。

本研究旨在分离一种新型植物激素（KAI2 配体；KL）和 AM 真菌衍生信号分子（KAI2 途径的 Myc 因子；Myc-K），作用于 D14L/KAI2 途径并控制 AM 真菌共生。除了(1)建立和纯化用于信号分子分离的检测系统和(2)D14l2a和D14l2b的功能分析之外，我们还计划(3)筛选在D14L/KAI2途径中起作用的转录因子作为备用情况（1）的计划是困难的。实验③在第一年就完成了，由于①进展顺利，所以没有进行实验③。因此，今年我们只进行了实验①。去年，我们建立了一个检测系统，通过 qPCR 定量 KL 诱导的 Lotus japonicus DLK2 的表达来检测 KL 活性。他们还发现水稻种子具有较高的KL活性，并正在着手对水稻种子提取物进行纯化。今年，我们成功地将一种称为直接逆转录的技术引入到该检测系统中。直接逆转录方法是由龙谷大学长野副教授及其同事开发的，允许使用植物片段而不是纯化的 RNA 来直接合成 cDNA。这显着提高了测定的效率。此外，我们使用正相和反相开柱和HPLC优化了水稻种子提取物的纯化条件，找到了使提取物纯化同时保持高活性的条件。尽管无法分离出该化合物，但在检查纯化条件的过程中，发现不仅提取物而且渗出液中也含有KL，并且不是单一化合物而是多种化合物具有KL活性，研究人员揭示了以前未知的特性。 KL作为化合物的特征，例如这些化合物含有至少一种中性物质和一种酸性物质的事实。