GPCRシグナル複合体細胞内輸送の時空間的制御に関する検討

GPCR信号复合物细胞内转运的时空控制研究

基本信息

批准号：
22590234
负责人：
柳澤輝行
金额：
$ 2.16万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22590234/
关键词：
受容体チャネル輸送系シグナル情報伝達系

项目摘要

GHRH受容体のGHRH刺激後の細胞表面発現量変動についての検討昨年度作成したGHRHRとタンパク質A両者を発現する細胞系を用いて、この受容体がGHRH刺激後に、細胞表面受容体発現量がどのように変化するのか、またタンパク質Aの発現が受容体の細胞表面発現にどのように影響するかについて抗GHRHR抗体を用いる蛍光免疫染色を行い、Flowcytometry法により定量を行った。その結果、受容体全長を発現させたものでは、GHRH刺激により受容体の細胞表面発現量が経時的に増加したのに対し、受容体のC末4アミノ酸欠損させたものではGHRH刺激にもかかわらず受容体の細胞表面発現量は変化しなかった。これは、受容体のC末4アミノ酸が受容体の細胞表面発現量は変化に重要であることを考えている。さらに受容体と相互作用する細胞内タンパク質Aを受容体とともに共発現させるとGHRH刺激後、一過性に受容体の細胞表面発現量は減少したがその後、増加に転じた。受容体の細胞表面発現量はリガンドであるGHRH刺激後増加したが、タンパク質A存在下では受容体の細胞内トラフィックが変化することが明らかになった。GHRHRのシグナル伝達におけるタンパク質Aの関与の検討GHRHRは、Gsタンパク質共役型GPCRであり、リガンドであるGHRHの結合により、細胞内cAMP濃度を亢進する。このGHRH刺激による細胞内cAMP濃度亢進においてGHRHRとタンパク質Aとの相互作用がどのように影響を与えているかについて検討を行った。すな診ち、cAMP濃度の細胞内変化をcAMP濃度に応答するプロモータとしてCRE(cAMP response element)、リポーター遺伝子のルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだプラスミドをGHRHRとタンパク質Aを発現する細胞にトランスフェクションを行い、cAMPレポーターアッセイ系の確立を行った。

检查 GHRH 刺激后细胞表面 GHRH 受体表达水平的变化使用去年创建的同时表达 GHRHR 和蛋白 A 的细胞系，我们使用荧光免疫染色研究了该受体在 GHRH 刺激后细胞表面表达水平的变化。采用抗GHRHR抗体测定Protein A的表达是否发生变化以及Protein A的表达如何影响细胞表面受体的表达，并采用流式细胞术方法进行定量。结果，在表达全长受体的细胞中，受体的细胞表面表达水平在 GHRH 刺激后随着时间的推移而增加，而在受体 C 端 4 个氨基酸被删除的细胞中，尽管 GHRH 刺激，但受体的 C 端 4 个氨基酸被删除。刺激后，受体的表达水平随时间增加，但细胞表面的受体表达水平没有变化。这是因为受体的C端4个氨基酸被认为对于改变受体的细胞表面表达水平很重要。此外，当与受体相互作用的细胞内蛋白A与受体共表达时，受体的细胞表面表达水平在GHRH刺激后短暂降低，但随后开始升高。尽管用配体 GHRH 刺激后受体的细胞表面表达水平增加，但研究表明，在蛋白 A 存在的情况下，受体的细胞内运输发生了改变。 GHRHR 信号转导中蛋白 A 参与的检验 GHRHR 是一种 Gs 蛋白偶联 GPCR，通过与其配体 GHRH 结合来增加细胞内 cAMP 浓度。我们研究了 GHRHR 和 Protein A 之间的相互作用如何影响 GHRH 刺激引起的细胞内 cAMP 浓度的增加。换句话说，为了检测细胞内cAMP浓度的变化，用含有CRE（cAMP响应元件）作为响应cAMP浓度的启动子和作为报告基因的荧光素酶基因的质粒转染表达GHRHR和蛋白A的细胞。建立了报告基因检测系统。