スンクス空腹期モチリン分泌機構の解明‐約１００分周期はどのように制御されるのか‐

阐明Suncus禁食期间胃动素的分泌机制——100分钟左右的时间是如何控制的？

基本信息

批准号：
18J14399
负责人：
竹見祥大
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Saitama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J14399/
关键词：
モチリン小腸オルガノイド CRISPR Suncus murinus 小腸オルガノイド Dibenzazepine

项目摘要

本研究は、空腹時に胃から下部小腸へと約100分周期で伝播する伝播性空腹期収縮（Migrating Motor Contraction; MMC）がどのように制御されるか明らかにすることを目的としており、そのために平成31年度は昨年度に引き続き、MMCの強収縮を引き起こすモチリンの転写・分泌制御機構についてスンクス小腸オルガノイドを用いて検討した。これまで、モチリンはげっ歯類では偽遺伝子化していることから研究が進んでおらず、本研究ではモチリンを産生する小型実験動物であるスンクスを用いている。これまで、スンクスで初めて小腸からオルガノイドを作製することに成功し、また安定して長期間培養することにも成功した。今年度は、モチリン産生株化細胞をスンクス小腸オルガノイドから作出するために、IRES-T antigen遺伝子をモチリン遺伝子下流にノックインすることを目的とした。IRES-T antigenを含むベクターコンストラクトを作製し、Cas9、guideRNAとともにスンクス小腸オルガノイドへトランスフェクションした。トランスフェクションしたベクター由来の蛍光タンパク質は確認できているが、未だモチリン遺伝子へのノックインは成功していない。それに加えて、蛍光レポーターであるtdTomato遺伝子をモチリン遺伝子下流にノックインするため、tdTomato遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を含むベクターを作製し、guideRNA、Cas9とともにスンクス小腸オルガノイドへトランスフェクションすることも試みた。ベクターの作製は終了したが、トランスフェクションは成功していない。

这项研究的目的是阐明如何控制迁移性运动收缩（MMC），它在禁食期间以大约 100 分钟的周期从胃传播到小肠下部，从去年开始，我们在 2019 财年研究了这种运动。使用 Suncus 小肠类器官研究胃动素的转录和分泌控制机制，从而导致 MMC 强烈收缩。到目前为止，关于胃动素的研究在啮齿类动物中尚未取得进展，因为它是假遗传产生的，而这项研究使用的是 Suncus，一种产生胃动素的小型实验动物。迄今为止，Sunkus首次成功从小肠中制备出类器官，并成功对其进行了长时间稳定培养。今年，我们的目标是敲入胃动素基因下游的 IRES-T 抗原基因，以便从 Suncus 小肠类器官中产生产生胃动素的细胞系。制备含有IRES-T抗原的载体构建体，并与Cas9和guideRNA一起转染至Suncus小肠类器官中。尽管来自转染载体的荧光蛋白已得到证实，但胃动素基因的敲入尚未成功。此外，为了敲入胃动素基因下游的荧光报告基因tdTomato基因，我们创建了包含tdTomato基因和新霉素抗性基因的载体，并尝试将其与guideRNA和Cas9一起转染到Suncus小肠类器官中。载体构建已完成，但转染尚未成功。