ＣａＭＫＩδの新規活性化メカニズム及び軟骨形成における生理機能の解明

阐明CaMKIδ的新激活机制及其在软骨形成中的生理功能

基本信息

批准号：
17J09227
负责人：
秋月一駿
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

当研究室では以前、ゼブラフィッシュ胚発生過程の鍵酵素としてカルモジュリン依存性プロテインキナーゼ Iδ (CaMKIδ) を同定した．本研究では、CaMKIδの新規活性化メカニズムおよび胚発生過程における生理機能の解明を試みた．CaMKIδのC末欠損変異体 [CaMKIδ(1-299)] は，CaMKKのリン酸化を受けなくても自己リン酸化で活性化することを見出した．そこで，CaMKIδ(1-299)の自己リン酸化部位を同定するため，MS/MSと点変異体を組み合わせた解析を行い，Ser296が活性化に重要な自己リン酸化サイトであることを明らかにした．また，CaMKIδのリン酸化ミミック変異体は，CaMKK存在下において，CaMKIδ(WT)よりも約4倍高いキナーゼ活性を示すことが判明した．以上から，CaMKIδはSer296のリン酸化を介した活性化メカニズムを持つことが示唆された (Akizuki et al., Arch. Biochem. Biophys., 2019)．ゼブラフィッシュ胚において，CaMKIδは軟骨形成を正に制御する可能性が示唆されている．我々は，CaMKIδと結合する転写因子 (Dlx1とDlx5) に着目した研究を行ってきたが，GST-Dlx1,5を基質にしたin vitroキナーゼアッセイの結果，GST-Dlx1,5はCaMKIδにほとんどリン酸化されないことが判明した．そこで，軟骨細胞分化のマスター因子 (Sox9) に着目し，Sox9がCaMKIδによってリン酸化されるかどうかを調べたところ，in vitroではわずかにリン酸化されたものの，細胞内でSox9はCaMKIδにリン酸化されないことが明らかになった．以上から，CaMKIδはDlx1,5/Sox9以外のタンパク質のリン酸化を介して軟骨形成を制御することが示唆された．

在这个实验室中，钙调蛋白依赖性蛋白激酶Iδ（CAMKIδ）先前被确定为斑马鱼胚胎发育过程的关键酶。在这项研究中，我们试图阐明CAMKIδ的新激活机制和胚胎发育过程中的生理功能。发现CaMKIδ的C末端变体[CAMKIδ（1-299）]通过自氧化而无需CAMKK磷光激活。因此，为了确定CAMKIδ的自磷酸化位点（1-299），将MS/MS和点金属的分析阐明，Ser296是激活的重要自氧化物。此外，发现CAMKIδ模拟氢氧化物突变体的激酶活性是CAMKK中CAMKI（WT）的四倍。从上面，建议CaMkiδ通过Ser296磷酸化具有活化的机制（Akizuki等，Arch。Biochys。，2019）。在斑马鱼胚胎中，Camkiδ提出可以完全控制软骨形成。我们一直在进行与CAMKIδ结合的转录因子（DLX1和DLX5）的研究，但是由于基于GST-DLX1和5，GST-DLX1和5的体外激酶测定，GST-DLX1和5几乎是LinCamkiδ原来它没有被氧化。因此，重点关注软骨细胞分化的主要因子（SOX9），并检查Sox9是否被CaMKIδ磷酸化，尽管它被体外略微磷酸化，Sox9磷酸化磷酸化。从上面，提出CAMKIδ通过蛋白质的DLX1,5/SOX9磷酸化控制软骨的形成。