リガンド依存的な濃度変化を利用したタンパク質の機能制御

使用配体依赖性浓度变化控制蛋白质功能

基本信息

批准号：
17J08108
负责人：
木村友紀
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

有価物質を効率よく生産する改良型微生物を探索するために，転写因子およびその制御遺伝子から構成される遺伝子スイッチを用いて，有価物質そのものや前駆体となる化合物の細胞内濃度を定量する試みが行われてきた。しかしながら，必ずしも標的分子を認識して機能する転写因子が天然に存在するとは限らず，また性能不充分であることもあるため，転写因子をそのままバイオセンサとして適用するには限界があった。そこで申請者は，タンパク質は何かしらの化合物と結合すると構造安定性が向上するという普遍的事実に着目して，結合安定化に伴う転写因子の実効濃度変化を利用したセンサ開発を進めてきた。採用第2年度では，初年度の研究で単離された亢進型転写因子LuxR変異体をベースに，さらに改変を加えてから酵素を融合することによって，標的代謝物を検出するセンサを開発できることを示した。採用第3年度では，さらにさまざまな酵素を融合し，その適用範囲を調査した。その結果，単に融合しただけで代謝物センサとして振舞うものもあったが，センサ挙動が認められないケースもあった。後者のような場合でも，進化工学を施すことによって，わずか数アミノ酸置換でセンサ性能は飛躍的に向上し，さらに変異を導入することによってセンサ特性を変えられることが分かった。最後に，改良したセンサを用いて，力価の異なる生合成酵素の活性を調べたところ，センサの出力強度と他の手法でのスコアに相関が見られた。このように，作製したセンサを使用することによって，従来の生合成工学を簡便化かつハイスループット化できることも示された。

为了寻找有效产生有价值物质的改进的微生物，已经尝试了使用由转录因子及其调节基因组成的基因开关来量化有价值物质和化合物的细胞内浓度和化合物。但是，由于通过识别目标分子识别和功能的转录因子不一定是自然发生的，并且性能可能不足，因此如何直接作为生物传感器应用转录因子是有限制的。因此，申请人的重点是普遍的事实，即蛋白质在与某种化合物结合时可以改善结构稳定性，并正在开发传感器，以利用与结合稳定相关的有效转录因子浓度变化的变化。在采用的第二年，我们证明了可以通过在luxR突变体进行进一步修饰后融合酶来开发靶代谢产物的传感器，这是第一年研究中分离出的增强的转录因子。在采用的第三年，进一步融合了各种酶，并研究了其申请范围。结果，有些仅通过融合而充当代谢产物传感器，但在某些情况下，没有观察到传感器的行为。即使在后一种情况下，已经发现，通过应用进化工程，只有几个氨基酸取代就可以大大改善传感器性能，并且可以通过引入进一步的突变来改变传感器特性。最后，当我们使用改进的传感器研究具有不同滴度的生物合成酶的活性时，我们发现传感器的输出强度与其他方法的分数之间存在相关性。通过这种方式，也已经表明，使用制造的传感器可以简化并增加高吞吐量的常规生物合成工程。