Functional analysis of the Bmznf-2 gene in sex determination of the silkworm Bombyx mori by transgenesis and genome editing

通过转基因和基因组编辑分析 Bmznf-2 基因在家蚕性别决定中的功能

基本信息

批准号：
17F17108
负责人：
嶋田透
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、カイコの性決定に関与する可能性があるBmznf-2遺伝子の機能を解明することである。先行研究により、培養細胞BmNにおいては、Bmznf-2の過剰発現が性決定の指標であるBmdsx遺伝子のスプライシングを雌型から雄型に変化させる。そこで、個体レベルにおけるBmznf-2遺伝子の機能をin vivoで明らかにするため、トランスジェネシスとGAL4/UASシステムによる遺伝子過剰発現と、TALEN法を用いたゲノム編集による遺伝子ノックアウトを行った。piggyBac法を用いて、UASの制御下でBmznf-2遺伝子を発現するトランスジェニック系統を作出した。導入したBmznf-2遺伝子を発現させるために、アクチンプロモーターA3の下流にGAL4遺伝子をもつトランスジェニックカイコ系統と交配した。次代において、両方の遺伝子すなわちA3-GAL4およびUAS-Bmznf-2の両者を有する個体は、Bmznf-2遺伝子を過剰に発現すると予想される。実際には、それら個体は若齢幼虫期に致死した。死亡個体ではBmdsxの性特異的スプラインシグに異常が見られた。一方、TALEN法によりBmznf-2遺伝子のノックアウトを試みた結果、破壊されたBmznf-2遺伝子をヘテロ接合で有する個体（Bmznf-2KO/+）を得ることができた。このヘテロ個体は、非常に虚弱であり、多くが幼虫期に斃死した。同じ蛾区でもノックアウト遺伝子ももたない+/+個体は正常に発育した。以上の結果は、Bmznf-2遺伝子の正常な発現がカイコの発育に不可欠であることを示唆している。

本研究的目的是阐明 Bmznf-2 基因的功能，该基因可能参与蚕的性别决定。先前的研究表明，在培养的 BmN 细胞中，Bmznf-2 的过度表达会改变 Bmdsx 基因的剪接，而 Bmdsx 基因是性别决定的指标，从雌性变为雄性。因此，为了在体内阐明Bmznf-2基因在个体水平上的功能，我们使用转基因和GAL4/UAS系统进行基因过表达，并使用TALEN方法通过基因组编辑进行基因敲除。使用piggyBac方法，我们创建了在UAS控制下表达Bmznf-2基因的转基因系。为了表达引入的Bmznf-2基因，我们将其与肌动蛋白启动子A3下游具有GAL4基因的转基因蚕品系杂交。在下一代中，同时具有 A3-GAL4 和 UAS-Bmznf-2 基因的个体预计会过度表达 Bmznf-2 基因。事实上，这些个体在幼虫阶段就死亡了。在死者的 Bmdsx 性别特异性样条中观察到异常。另一方面，通过TALEN法尝试敲除Bmznf-2基因，得到了Bmznf-2基因被破坏的杂合个体(Bmznf-2KO/+)。这些杂合个体非常虚弱，许多在幼虫阶段就死亡了。即使在同一个飞蛾小区中，没有敲除基因的+/+个体也能正常发育。这些结果表明Bmznf-2基因的正常表达对于家蚕发育至关重要。