CCN2/CTGFに結合するタンパク質の同定と機能解析

CCN2/CTGF 结合蛋白的鉴定和功能分析

基本信息

批准号：
10J04293
负责人：
星島光博
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

CCN2/CTGFは軟骨に強い発現を示し、軟骨細胞の増殖・分化や線維芽細胞や血管内皮細胞の接着・遊走など多彩な生理機能を発揮するが、一方で異所性の過剰な発現が種々の線維症や癌細胞で観察されることから、生体内では発現量やその活性は厳密にコントロールされていると思われる。昨年度までに我々は軟骨細胞様細胞株HCS-2/8より作製したcDNAライブラリーからCCN2と結合する因子として、CCNファミリーに属するCCN3とCCN2自身を同定した。また、これらの分子が結合し、アグリカンmRMの発現を制御している事を報告した。今年度は、さらにCCN2とCCN3間の結合の生理的意義を明らかにすることを目的とし、以下の結果を得た。1)アグリカンと同様に、HCS-2/8細胞においてH型コラーゲンmRNAレベルが、リコンビナントCCN2添加により上昇し、リコンビナントCCN3添加で低下すること、CCN3によるH型コラーゲンmRNAの発現抑制は、CCN2の濃度依存的に回復することを示した。2)HCS-2/8細胞における内在性のCCN2とCCN3が結合することを、それぞれの抗体を用いた免疫沈降により確認した。3)蛍光免疫染色により、内在性のCCN2とCCN3が細胞表面および細胞内で共局在していることを明らかにした。以上の結果より、CCN2は軟骨細胞において基質合成を促進する一方で、CCN3単独ではこれを抑制するが、CCN3はCCN2とヘテロダイマーを形成することで、軟骨細胞の基質産生を促進することが示された。このことはCCN2とCCN3が相互作用することで、互いの活性を厳密に調節し、生体内における軟骨組織の恒常性を維持している可能性を示唆している。さらに、CCN2の結合蛋白質の一つとして、細胞内の小胞輸送に関与する低分子量G蛋白質であるRab14 GTPaseを新たに同定した。CCN2とRab14が相互作用し、軟骨細胞においてプロテオグリカンを含む小胞の輸送に関与している可能性を示すデータを得ている。このことはCCN2がRab14のエフェクター分子として作用し、細胞内のシグナル伝達機構に関与することを示唆しており、軟骨細胞の機能を解明するための新たな知見である。

CCN2/CTGF在软骨中强烈表达，并发挥多种生理功能，例如软骨细胞的增殖和分化以及成纤维细胞和血管内皮细胞的粘附和迁移，因为在纤维化和癌细胞中观察到了它的表达水平。和活性在体内受到严格控制。去年，我们从软骨细胞样细胞系HCS-2/8制备的cDNA文库中鉴定出属于CCN家族的CCN3和CCN2本身作为与CCN2结合的因子。我们还报道了这些分子结合在一起并控制聚集蛋白聚糖 mRM 的表达。今年，我们旨在进一步阐明CCN2和CCN3之间键的生理意义，并获得了以下结果。 1)与聚集蛋白聚糖类似，HCS-2/8细胞中H型胶原mRNA水平随着重组CCN2的添加而增加，并随着重组CCN3的添加而减少；CCN3对H型胶原mRNA表达的抑制取决于CCN2的浓度。结果表明，恢复以依赖性方式发生。 2)使用各自的抗体通过免疫沉淀证实HCS-2/8细胞中内源性CCN2和CCN3的结合。 3)荧光免疫染色显示内源性CCN2和CCN3共定位于细胞表面和细胞内。上述结果表明，CCN2促进软骨细胞中的基质合成，而CCN3单独抑制这种情况，但CCN3通过与CCN2形成异二聚体来促进软骨细胞中的基质生成。这表明CCN2和CCN3可能相互作用以严格调节彼此的活动并维持体内软骨组织的稳态。此外，我们新鉴定出 Rab14 GTPase（一种参与细胞内囊泡转运的低分子量 G 蛋白）作为 CCN2 结合蛋白之一。我们获得的数据表明CCN2和Rab14相互作用并且可能参与软骨细胞中含有蛋白聚糖的囊泡的运输。这表明CCN2作为Rab14的效应分子，参与细胞内信号转导机制，是阐明软骨细胞功能的新知识。