エンドソーム不安定化ペプチドを用いた細胞内抗体導入法の開発と細胞機能制御

利用内体不稳定肽开发细胞内抗体导入方法和细胞功能控制

• 批准号: 16J09206
• 负责人: 秋柴 美沙穂
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J09206/
• 关键词: 細胞内送達; エンドソーム不安定化ペプチド; 膜透過; マクロピノサイトーシス; 抗体の細胞内送達; 抗体結合ドメイン; 抗体の細胞内移行

研究実施者らは、クモ毒由来の膜傷害性ペプチドを改変し、エンドソーム不安定化ペプチドL17Eを開発した。L17Eを用いることで、通常エンドサイトーシス機構により細胞内に取り込まれ、エンドソームに捕捉される細胞外分子をサイトゾルに移行させることが可能である。本研究では、エンドソーム不安定化ペプチドの活性向上のための指針を得ることを目的とし、L17Eの作用機序解明に取り組んだ。L17Eには、マクロピノサイトーシスを誘導する・負電荷脂質に選択的に作用するという類似のエンドソーム不安定化分子には見られない性質を有する。これらの性質が細胞のどの点でどのように作用し、高分子の細胞内送達を実現しているかを明らかにすることを目指した。高分子の細胞質内への送達を評価するために、高分子薬物モデルとして蛍光標識デキストラン（10kDa）を用いた。L17Eと共にデキストランを細胞に投与すると、デキストランがサイトゾルに移行する。このサイトゾルへの放出は、低温条件、ATP欠乏条件では認められないことから、エネルギー依存的なエンドサイトーシス経路を介していることが示唆された。時間依存性・エンドソームの成熟化および酸性化の関与を検討したところ、エンドソームの成熟化が進行する以前の比較的短い時間でサイトゾル放出が起こることが明らかとなった。さらに、マクロピノサイトーシスの誘導過程であるラッフリングが関与することを示唆する結果が得られた。これらに加えて、L17E処理によって細胞膜が撹乱され、一時的な細胞膜透過が起こる可能性が示唆された。細胞膜の攪乱はエネルギー依存的であり、ラッフリングの誘導が必要である可能性が考えられた。以上の結果はリソソーム分解系への移行を回避した、細胞膜上でのサイトゾルへの導入の可能性を示唆しており、細胞内送達法の開発に新たな概念を与えるものだと期待できる。

研究人员通过修饰源自蛛网毒液的膜破坏肽来开发内体破坏肽L17E。通过使用L17E，可以通过内吞作用机制将通常掺入细胞并被内体捕获的细胞外分子转移到细胞质中。这项研究旨在获得改善内体不稳定肽活性的准则，我们致力于阐明L17E的作用机理。 L17E在类似的内体不稳定分子中没有发现的特性，从而诱导大型细胞增多症并有选择地作用于带负电荷的脂质上。我们旨在阐明这些特性如何在细胞中的哪些点起作用，从而实现大分子的细胞内递送。为了评估大分子的胞质内递送，将荧光标记的葡萄糖（10 kDa）用作聚合物药物模型。当将葡聚糖施用到具有L17E的细胞上时，将葡萄糖转移到细胞质中。在低温条件或ATP缺乏条件下未观察到该释放到细胞质中，这表明它是通过能量依赖性的内吞作用途径。当研究时间依赖性内体成熟和酸化的参与时，揭示了胞质释放发生在内体成熟之前相对较短的时间内发生。此外，结果表明，Ruffling涉及诱导大型细胞增多症的过程。除此之外，还建议L17E治疗可能导致细胞膜干扰，从而导致临时细胞膜渗透。据认为，细胞膜的破坏是能量依赖性的，并且需要诱导荷叶边。以上结果表明可能会引入细胞膜上的胞质溶胶，避免过渡到溶酶体降解系统，并有望为细胞内递送方法的发展提供新的概念。

项目成果

クモ毒由来ペプチドL17Eを用いた高分子の細胞内導入メカニズムの検討

利用蜘蛛毒液衍生肽 L17E 检查细胞内导入大分子的机制

• 发表时间: 2018
• 作者: 秋柴美沙穂;二木史朗
• 通讯作者: 二木史朗

エンドソーム膜を不安定化する新規ペプチドの開発と抗体の細胞内送達

开发破坏内体膜稳定性和细胞内抗体递送的新型肽

• 发表时间: 2017
• 作者: 秋柴美沙穂;武内敏秀;川口祥正;坂本健太郎;二木史朗
• 通讯作者: 二木史朗

エンドソーム不安定化ぺプチドを用いた細胞内への機能性タンパク質の導入

使用内体不稳定肽将功能蛋白引入细胞

• 发表时间: 2018
• 作者: 秋柴美沙穂;武内敏秀;川口祥正;坂本健太郎;中瀬生彦;二木史朗
• 通讯作者: 二木史朗

Redesign of hemolytic peptides to antibody delivery agent by single glutamate substitution

通过单一谷氨酸取代将溶血肽重新设计为抗体递送剂

• 发表时间: 2017
• 作者: Misao Akishiba;Toshihide Takeuchi;Yoshimasa Kawaguchi;Kentarou Sakamoto;Ikuhiko Nakase and Shiroh Futaki
• 通讯作者: Ikuhiko Nakase and Shiroh Futaki

L17E-mediated Cytosolic Delivery and its Mode of Action

L17E介导的胞浆传递及其作用方式

• 发表时间: 2018
• 作者: 秋柴美沙穂;二木史朗;Misao Akishiba and Shiroh Futaki
• 通讯作者: Misao Akishiba and Shiroh Futaki