求核付加・解離平衡に基づく多色・多機能な超解像蛍光イメージングプローブ群の開発

基于亲核加成/解离平衡的多色多功能超分辨荧光成像探针的研制

• 批准号: 16J08291
• 负责人: 両角 明彦
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J08291/
• 关键词: 蛍光プローブ; 超解像イメージング; キサンテン系色素; グルタチオン; 求核付加・解離

SMLMは蛍光色素を確率的に明滅させることで超解像蛍光画像を構築する技術である。本研究では、細胞内グルタチオン（GSH）の求核付加・解離平衡という新規明滅原理に基づく多色・多機能なSMLM用色素の開発を行う。昨年度までに、2種の候補色素骨格CP550およびSiP650を見出し、固定細胞および生細胞において、SMLMへの応用を達成した。本年度は主に下記2項目に取り組んだ。１．CP550の応用範囲の拡張：まず、タンパク質タグであるSNAP-tagの基質となる部分構造を付与した誘導体を新たに合成し、評価した。その結果、生細胞内の観察対象の特異的標識および超解像観察を達成した。生細胞における標識手段としてSNAP-tagを利用可能としたことで、本色素および本研究の有用性がより強く示された。さらに、今後の実用上も重要な複数の応用実験・解析例を示した。第一に、先行研究のHMSiRと併用しての2色観察を行った。このような自発明滅型色素による生細胞2色SMLMは、本研究によって初めて実現可能となった。第二に、経時観察に関して、データの取得から解析までの方法論を確立し、様々な時間スケールでその実例を示した。２．photoactivatable型色素に関する検討：可視光刺激によりGSHの解離、すなわち蛍光性状態分子の生成を促進（photoactivate）できる色素分子の開発と応用を試みている。キサンテン環を拡大した候補色素を新たに数種類合成し、GSHとの親和性および反応性、また光応答挙動とそのGSH濃度依存性を評価した。その結果、当該蛍光色素がphotoactivatable型のSMLM用蛍光色素として、あるいはGSH付加反応の速度からGSH濃度を定量できる分子ツールとして応用されうることが示唆された。今後は溶液条件や照射光条件等の因子も考慮しながら、応用の可能性や方向性を検討していく。

SMLM是一种通过随机闪烁荧光染料构建超分辨率荧光图像的技术。在这项研究中，我们将基于细胞内谷胱甘肽（GSH）亲核加成/解离平衡的新颖闪烁原理，开发一种用于 SMLM 的多色多功能染料。截至去年，我们已经发现了两种候选色素支架CP550和SiP650，并已成功将它们应用于固定细胞和活细胞中的SMLM。今年，我们主要做了以下两方面的工作。 1.扩大CP550的应用范围：首先，我们合成并评估了一种具有部分结构的新衍生物，可以作为蛋白质标签SNAP-tag的底物。结果，我们实现了活细胞内待观察物体的特异性标记和超分辨率观察。 SNAP-tag 作为活细胞标记手段的可用性进一步证明了这种染料和这项研究的有用性。此外，我们还提供了几个对未来实际使用很重要的应用实验和分析示例。首先，我们在之前的研究中使用 HMSiR 进行了双色观察。这项研究首次使得使用这种创造性染料实现活细胞的双色 SMLM 成为可能。其次，关于时间观察，我们建立了从数据采集到分析的方法论，并在不同时间尺度上论证了其方法论。 2.光活化染料的研究：我们正在尝试开发和应用能够通过可见光刺激促进（光活化）GSH解离，即产生荧光态分子的染料分子。我们合成了几种具有扩大呫吨环的新候选染料，并评估了它们与 GSH 的亲和力和反应性，以及它们的光响应行为及其对 GSH 浓度的依赖性。结果表明，荧光染料可以用作 SMLM 的光活化荧光染料，或作为可以根据 GSH 加成反应速率量化 GSH 浓度的分子工具。未来我们会在考虑溶液条件、照射光条件等因素的同时，考虑应用的可能性和方向。

项目成果

Development of spontaneously blinking fluorophores based on nucleophilic addition of intracellular glutathione for super-resolution imaging

基于细胞内谷胱甘肽亲核添加的自发闪烁荧光团的开发用于超分辨率成像

• 发表时间: 2019
• 作者: Shin-nosuke Uno;Mako Kamiya;Akihiko Morozumia;Yasuteru Urano;両角明彦，神谷真子，宇野真之介，梅澤啓太郎，吉原利忠，飛田成史，浦野泰照;両角明彦
• 通讯作者: 両角明彦

細胞内グルタチオンの求核付加・解離平衡に基づく超解像蛍光イメージングプローブの開発

基于细胞内谷胱甘肽亲核加成/解离平衡的超分辨荧光成像探针的研制

• 发表时间: 2017
• 期刊: バイオイメージング
• 作者: Shin-nosuke Uno;Mako Kamiya;Akihiko Morozumia;Yasuteru Urano;両角明彦，神谷真子，宇野真之介，梅澤啓太郎，吉原利忠，飛田成史，浦野泰照
• 通讯作者: 両角明彦，神谷真子，宇野真之介，梅澤啓太郎，吉原利忠，飛田成史，浦野泰照

A green-light-emitting, spontaneously blinking fluorophore based on intramolecular spirocyclization for dual-colour super-resolution imaging

• DOI: 10.1039/c7cc07783a
• 发表时间: 2018-01-04
• 期刊: CHEMICAL COMMUNICATIONS
• 影响因子: 4.9
• 作者: Uno, Shin-nosuke;Kamiya, Mako;Urano, Yasuteru
• 通讯作者: Urano, Yasuteru