遺伝子改変ブタ及びクローンブタを用いたトランスレーショナル・リサーチに関する研究

利用转基因和克隆猪进行转化研究

基本信息

批准号：
09J10707
负责人：
松成ひとみ
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Meiji University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

【実施内容】我々は、レトロウイルスベクターを用いてKusabira-Orange(huKO)遺伝子を導入した、全身性に赤色蛍光を示す遺伝子改変(Tg)クローンブタの作出に成功している。前年度に引き続き、このTgクローンブタの後代産仔を作出し、産仔における遺伝子伝達動態ならびにその表現型を解析した。本年度は、前年度に獲得した第1世代(G1)雄の凍結精子から、人工授精(AI)あるいは体外受精(IVF)によって第2世代(G2)産仔を作出することに成功した。G2世代は12回の分娩で77頭(雌:34頭、雄:43頭)の産仔が得られ、そのうち39頭がTgであった。Tg産仔率は50.6%(39/77)であり、メンデリズムに従ってhuKO遺伝子が後代に伝達されていることが確認された。さらに、Founder Tgクローン世代、G1、G2世代ブタのhuKO遺伝子はFISH解析により第17染色体q12領域の一箇所に挿入されていることが確認された。G2世代の個体にはFounder Tgクローンに見られた全身性赤色蛍光発現の表現型が引き継がれていた。得られたTg産仔は、靭帯再建研究、ハイドロキシアパタイトを用いた骨修復研究、新生仔肝細胞移植研究(いずれも共同研究)に使用され、赤色蛍光の細胞マーカーとしての有用性が実証された。【意義・重要性】レトロウイルスベクターにより導入されたhuKO遺伝子は2世代の有性生殖を経た後もジーンサイレンシングを受けることなく発現が維持されること、導入されたhuKO遺伝子はFISH解析により染色体上の一箇所に1コピー挿入されていることが明らかになったことは、Tg動物として系統化を図る上で重要な知見である。すなわち、継代によって導入遺伝子のコピー数が変動しない、安定的なTgブタの系統が確立されたと言える。獲得したhuKO後代産仔が整形外科、小児科、再生医療等の研究に用いられ、顕著な果が上がっていることから、本研究の最終目的であるへのhuKO Tgブタの利用が十分に達成できたと考える。凍結精子を用いた、体外受精や人工授精による増殖法も確立されたので、今後一層huKO Tgブタの研究利用が進展すると考えられる。

[内容] 我们通过逆转录病毒载体导入Kusabira-Orange（huKO）基因，成功培育出一头表现出全身红色荧光的转基因（Tg）克隆猪。延续去年，我们培育了这头Tg克隆猪的后代，并分析了后代的基因转移动态和表型。今年，我们利用前一年获得的第一代（G1）雄性的冷冻精子，通过人工授精（AI）或体外受精（IVF）成功产生了第二代（G2）后代。在G2代中，通过12次分娩获得了77个后代（34个雌性，43个雄性），其中39个为Tg。 Tg产仔率为50.6%（39/77），证实huKO基因根据孟德尔主义遗传给后代。此外，FISH分析证实，Founder Tg克隆代、G1和G2代猪的huKO基因插入在17号染色体q12区域的单个位置。 G2 代个体继承了在 Founder Tg 克隆中观察到的全身红色荧光表达。获得的Tg幼崽用于韧带重建研究、使用羟基磷灰石的骨修复研究和新生儿肝细胞移植研究（均为联合研究），并证明了红色荧光作为细胞标记物的有用性。 [意义/重要性]逆转录病毒载体导入的huKO基因的表达即使在两代有性生殖后也能维持在没有基因沉默的情况下，并且发现导入的huKO基因在染色体的同一位置插入了一个拷贝的发现以上是Tg动物系统发育的重要发现。换句话说，可以说已经建立了稳定的Tg猪品系，其中导入基因的拷贝数不会因传代而改变。所获得的huKO后代已应用于骨科、儿科、再生医学等方面的研究，并取得了显着的成果，因此，我们相信本研究的最终目的——利用huKO Tg猪已经完全实现。我认为是这样。由于体外受精和人工授精等使用冷冻精子的繁殖方法已经建立，预计未来huKO Tg猪在研究中的使用将进一步推进。