標的分子と特異的に共有結合を形成する特殊ペプチドの探索

寻找与目标分子特异性形成共价键的特殊肽

基本信息

批准号：
16J05654
负责人：
小澤直也
金额：
$ 1.79万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J05654/
关键词：
特殊ペプチドスクリーニング共有結合

项目摘要

本研究では、反応性官能基を持つ環状ペプチドライブラリーを構築し、標的との共有結合形成能力を指標としたスクリーニング法を確立することを目指している。今年度は、前年度のスクリーニングで発見したペプチドについてさらに詳細な評価を行うとともに、別のタンパク質を標的としたスクリーニングも実施した。まず、寄生虫由来のタンパク質と共有結合を形成することが確認されていた2種類のペプチドについて、結合部位を調べた。標的タンパク質をペプチドと反応させた後にプロテアーゼで分解し、断片をLC-MSで分析することで、ペプチドが結合しているアミノ酸残基を特定した。次に、これらのペプチドの一方をモデルとして、共有結合形成速度を合理的設計によって変更することを試みた。本研究で使用した反応性官能基は小さな置換基であるフッ素を導入することで構造変化を最小限にしながら脱離基の酸性度を容易に変更できるように設計されているため、ペプチドと標的タンパク質の間の共有結合形成速度を合理的設計によって容易に変更できると期待される。そこで、反応性官能基に含まれるフッ素の個数と位置を変化させた複数のペプチドを化学合成し、標的タンパク質と一定時間反応させた。脱離基の酸性度が高いほどペプチドが結合したタンパク質が増えたため、共有結合形成速度を合理的に変更できることが確認された。さらに、本研究の手法の汎用性を検証するためにEGFRを標的としたスクリーニングを行い、EGFRと共有結合を形成すると期待されるペプチドを1種類同定した。このペプチドを蛍光標識したものを化学合成し、EGFRと反応させてSDS-PAGEで分析したところ、EGFRが蛍光を示したため共有結合形成が確認された。また、他の3種類のタンパク質との反応も調べたところ、EGFRと選択的に反応することが確認された。

在这项研究中，我们旨在构建具有反应官能团的环状肽库，并基于与目标形成共价键的能力建立筛选方法。今年，我们对上一年筛查中发现的肽进行了更详细的评估，并筛选了针对其他蛋白质的筛查。首先，检查了两种类型的肽，这些肽已被证实与源自寄生虫的蛋白质形成共价键。将靶蛋白与肽反应，然后用蛋白酶降解，并通过LC-MS分析片段，以鉴定肽与肽与之结合的氨基酸残基。然后，我们尝试使用其中一种作为模型来改变合理设计的共价键形成速率。本研究中使用的反应性官能团旨在轻松改变离开组的酸度，同时通过引入小型取代氟通过最小化结构变化，因此可以预期，肽和靶蛋白之间的共价形成速率可以通过合理设计轻松改变。因此，对反应性功能组中氟的数量和位置的多个肽进行了化学合成，并与靶蛋白在一定时间段内反应。已经证实，离开组的酸度越多，肽与肽结合的蛋白质越多，并且可以合理地改变共价键形成的速率。此外，为了验证这项研究方法的多功能性，我们进行了筛选针对EGFR的筛选，并确定了一种类型的肽，该肽有望与EGFR形成共价键。该肽与荧光标签化学合成，与EGFR反应并通过SDS-PAGE进行分析，EGFR显示荧光，并确认了共价键的形成。此外，当我们研究与其他三种蛋白质的反应时，它证实它与EGFR有选择性反应。