ｍＴＯＲＣ１が引き起こす脱リン酸化機構の解析

mTORC1诱导的去磷酸化机制分析

• 批准号: 16J03514
• 负责人: 松本 結香
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J03514/
• 关键词: mTORC1; FOXK2; 脱リン酸化; FOXK1

本研究では、mTORC1の下流で引き起こるFOXK1, FOXK2, PBX2等の転写因子の脱リン酸化機構を解明する。前回報告した通り、生化学的手法による脱リン酸化酵素の道程は困難であることから、CRISPR/Cas9 sgRNAライブラリーを用いた遺伝学的手法にシフトした。まず行なったのはスクリーニング系の立ち上げである。我々が選び出したいのは目的の脱リン酸化酵素がKOされた細胞で、言い換えるとInsulinを与えてもFOXK1が脱リン酸化されず、その下流であるCCL2の発現が上昇しない細胞である。このためにはCCL2の発現を可視化してモニタリングできることが好ましい。そこで我々はHeLa細胞のCCL2プロモーター下にEGFP遺伝子をKIし、CCL2の発言に応じて細胞が光るように設計した。また、CCL2はTNF-aの下流でも制御されているので、その影響を排除するために同時にRel-A KOを行なった。得られた細胞をFACSを用いて評価したところ、WTと比べてKIした細胞ではEGFPの発現増強が観察されたが、Insulin投与による発現増強は観察されなかった。この原因としては、まだ遺伝子の中にPGK-puroRが残っていることや、そもそもCCL2プロモーター下にEGFPをいれるという設計が悪かった可能性もあるため、これらの改善が必要であると考えられる。また、CRISPRの手法を用いてFOXK2またはPBX2のKOマウスの作成にも着手している。pCAG-EGxxFPを用いて最適のgRNAの選択まで行なった。

这项研究阐明了MTORC1下游发生的转录因子（例如FOXK1，FOXK2和PBX2）的去磷酸化机制。正如上次报道的那样，很难使用生化技术去磷酸化的途径，因此我们使用CRISPR/CAS9 SGRNA库转移到了遗传技术。我们要做的第一件事是启动筛选系统。我们要选择的是曾经是具有靶标去磷酸化酶的KO的细胞，换句话说，即使给出了胰岛素，也不会脱磷酸化FOXK1的细胞，而下游CCL2的表达也不会增加。为此，首选可以可视化和监测CCL2表达式。因此，我们在HeLa细胞的CCL2启动子下Ki ki ki eGFP基因，并根据CCL2的陈述而设计为减轻细胞。此外，由于CCL2也受到TNF-A下游的控制，因此我们同时执行了Rel-A KO以消除其效果。当使用FACS评估所获得的细胞时，与WT相比，在接受KI的细胞中观察到EGFP的表达增加，但通过胰岛素给药没有观察到增加的表达。原因是PGK-PUROR仍然保留在基因中，并且CCL2启动子下的EGFP的设计首先很差，因此人们认为这些改进是必要的。我们还开始使用CRISPR技术创建FOXK2或PBX2 KO小鼠。使用PCAG-EGXXFP选择最佳GRNA。