ゼブラフィッシュ側線神経系をモデルとした神経回路形成機構の解析

以斑马鱼侧线神经系统为模型分析神经回路形成机制

基本信息

批准号：
09J06524
负责人：
佐藤朗
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

1.ゼブラフィッシュ側線系の単一細胞における遺伝子発現解析法を確立した今年度の研究では、側線神経の細胞集団内に混在する2つのサブタイプ;LeaderとFollowerを決定するメカニズムを解明するため、両者の遺伝子発現の比較を行った。そのためにまず側線系の単一神経細胞における遺伝子発現解析法を確立した。具体的には、単一細胞に由来するcDNAライブラリを合成・増幅し、ライブラリに含まれる各cDNAの量をqPCRと次世代シーケンシングによって調べることで、単一細胞における発現解析が可能となった。2.側線神経細胞のサプタイプは転写因子neurodの発現量によって決まることを明らかにした上記の発現解析法を用いて、LeaderとFollowerの遺伝子発現を比較した。その結果、神経分化に関わる転写因子neurodの発現量がLeaderで有意に高いことが明らかになった。この結果から、側線神経の分化初期(Leader,Followerの分化前)にneurod発現量の高い細胞がLeaderへと分化することが予想される。その場合、neurodの発現量は分化初期から多様化していることが必要である。初期胚における発現解析の結果、実際にneurod発現量の多様化がLeader,Followerの分化に先立って生じることが確認された。neurod発現量によってサブタイプが決まる可能性をさらに検証するため、単一細胞においてneurod過剰発現を行い、その細胞がLeaderへ分化するかどうかを調べた。その結果、Leaderへの分化はneurod過剰発現によって有意に促進され、上記の仮説が強く支持された。以上の成果は、遺伝子の(発現の有無ではなく)発現量が神経細胞のサブタイプを決めているという、神経細胞集団の多様化メカニズムの一端を明らかにしたものである。

1. 今年的研究建立了斑马鱼侧线系统单细胞基因表达分析方法，旨在阐明决定斑马鱼侧线系统细胞群中共存的两种亚型（Leader和Follower）的机制。比较两者的基因表达。为此，我们首先建立了侧线系统单个神经元基因表达分析的方法。具体而言，通过合成并扩增来自单个细胞的cDNA文库，并使用qPCR和下一代测序检查文库中包含的每种cDNA的量，使得单个细胞中的表达分析成为可能。 2.我们阐明侧线神经元的亚型是由转录因子neurod的表达水平决定的。利用上述表达分析方法，我们比较了Leader和Follower的基因表达量。结果显示，参与神经分化的转录因子neurod的表达水平在Leader中显着升高。从该结果可以预测，具有高neurod表达的细胞在侧线神经分化的早期阶段（分化为领导者和追随者之前）分化为领导者。在这种情况下，neurod的表达水平需要从分化的早期阶段开始多样化。作为早期胚胎中表达分析的结果，证实神经元表达水平的多样化实际上发生在领导者/跟随者分化之前。为了进一步研究 Neurod 表达水平决定亚型的可能性，我们在单细胞中过度表达 Neurod 并检查细胞是否分化为前导细胞。结果，神经元过度表达显着促进了前导分化，有力地支持了上述假设。上述结果阐明了神经元细胞群体多样化的部分机制，其中基因的表达水平（而不是存在或不存在）决定了神经元细胞的亚型。