「生まれ」の時期の違いを利用する遺伝子導入法を用いた線条体区画構造の神経活動解析

利用出生时间差异的基因转移方法对纹状体区室结构进行神经活动分析

基本信息

批准号：
16J02501
负责人：
奥宮太郎
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J02501/
关键词：
線条体 patch matrix Dlx1 Dlx5 顕微内視鏡パッチマトリックスカルシウムイメージング

项目摘要

1）「生まれ」すなわち発生時期の違いを利用して，線条体パッチ区画およびマトリックス区画選択的な遺伝子導入法を開発した．まずパッチ区画の標識のため，Dlx5-CreERT2アレルとR26-CAG-LoxP-mTFP1アレルをもつダブルヘテロマウスを作成した．胎齢12日目に4-OHTを投与することにより，早生まれのパッチ区画選択的にmTFP1蛍光タンパク質を発現させた．次にマトリックス区画の標識のため，Dlx1-CreERT2アレルとR26-CAG-LoxP-mTFP1アレルをもつダブルヘテロマウスを作成した．胎齢15日目にtamoxifenを投与することにより，遅生まれのマトリックス区画選択的にmTFP1を発現させた．成体の組織切片を用いて標識の区画選択性を確認した．2）上記遺伝子導入方法を用いて，区画選択的なカルシウムイメージングを行う実験系を構築した．まずDlx5-CreERT2マウスと，Cre組換え依存的にGCaMP3を発現するAi38マウスを交配し，4-OHT投与により早生まれ神経細胞へのGCaMP3導入を試みた．しかし，GCaMP3アレルの組み換え効率がR26-CAG-LoxP-mTFP1アレルに比べかなり低く，内視鏡下の観察は困難であった．そこで，区画選択的にmTFP1を発現させたマウスに，アデノ随伴性ウイルスベクターを用いて赤色カルシウム感受性蛍光タンパク質RCaMPを区画非選択的に発現させた．作成したマウス線条体に光ファイバーを用いた顕微内視鏡を埋め込んだ結果，自由行動下のマウスで，mTFP1で標識された線条体区画領域を内視鏡視野内に緑色で確認し，RCaMPの輝度変化を赤色で観察できることがわかった．学習課題中の神経活動を記録することはできなかったが，本研究の核心である自由行動下における線条体区画選択的なカルシウムイメージングが技術的に可能であることを示した．

1）我们利用“出生”或发育时间的差异，开发了一种针对纹状体斑块区室和基质区室选择性的基因转移方法。首先，为了标记补丁区室，我们创建了携带 Dlx5-CreERT2 等位基因和 R26-CAG-LoxP-mTFP1 等位基因的双杂合小鼠。通过在妊娠第12天给予4-OHT，mTFP1荧光蛋白在早产小鼠的斑块区室中选择性表达。接下来，为了标记基质隔室，我们创建了携带 Dlx1-CreERT2 等位基因和 R26-CAG-LoxP-mTFP1 等位基因的双杂合小鼠。通过在妊娠第 15 天给予他莫昔芬，mTFP1 在晚产儿的基质区室中选择性表达。使用成人组织切片证实了标记的区室选择性。 2）利用上述基因转移方法，我们构建了隔室选择性钙成像实验系统。首先，我们将 Dlx5-CreERT2 小鼠与 Ai38 小鼠杂交，Ai38 小鼠以 Cre 重组依赖性方式表达 GCaMP3，并尝试通过施用 4-OHT 将 GCaMP3 引入早产神经元中。然而，GCaMP3等位基因的重组效率明显低于R26-CAG-LoxP-mTFP1等位基因，使得内镜观察变得困难。因此，我们使用腺相关病毒载体在区室选择性表达 mTFP1 的小鼠中以区室非选择性方式表达红色钙敏感荧光蛋白 RCaMP。将使用光纤的显微内窥镜植入到制作的小鼠纹状体中，结果发现，在自由活动的小鼠的内窥镜视野内，用mTFP1标记的纹状体区室区域呈绿色，并且RCaMP发现可以观察到亮度的变化。观察为红色。尽管我们无法记录学习任务期间的神经活动，但我们证明了自由运动期间纹状体区室选择性钙成像（本研究的核心）在技术上是可行的。