進化工学と有機合成の融合による革新的蛍光プローブの開発

通过进化工程和有机合成的融合开发创新荧光探针

• 批准号: 16J01710
• 负责人: 寺井 琢也
• 金额: $ 7.49万
• 依托单位: Saitama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J01710/
• 关键词: 進化分子工学; ペプチド化学; 蛍光センサー; 合成化学

前年度までに確立したcDNA display技術を活用して、引き続き蛍光修飾ペプチドライブラリを使った「標的タンパク質に結合することで発光特性が変わる蛍光プローブ」および「プロテアーゼに対する特異的発蛍光基質」の開発を行った。前者に関しては、各候補ペプチド配列の「蛍光変化」を直接検出可能なフローサイトメーター（FACS）評価系を利用した2段階セレクションシステムを立ち上げるため、ペプチドライブラリをコードするＤＮＡを酵母発現用のプラスミドに導入し、酵母表面に候補ペプチドを発現させて蛍光修飾した。続いてFACSで個別の蛍光を測定・分取することによりセレクションを行った。しかし、細胞表面の内在性タンパク質の影響が予想より大きくＳ／Ｎの良いセレクションを実施する事は出来なかった。そこでマイクロビーズ表面にＤＮＡとペプチドを修飾する新たな系を構築することを試みた。種々の条件検討の結果、２種類のモデルＤＮＡを別々のビーズ上に結合させ、夫々に対応するペプチドを当該ビーズ上に固定して分取することに成功した。また後者においては、プロテアーゼによって切断を受けたペプチド配列をセレクションするシステムの構築に前年度の研究で概ね成功している。そこで今年度は更に条件検討を進め、実際にランダムライブラリからの基質セレクションを行った。その結果、セリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼに対して効率よく酵素反応を受けるペプチド配列を濃縮し、次世代シークエンス解析によって基質配列に関する知見を得ることができた。

使用直到上一年建立的cDNA显示技术，我们继续开发“与靶蛋白结合时会改变发光特性的荧光探针”和使用荧光修饰的肽库的“蛋白酶的特定荧光底物”。关于前者，为了使用流式细胞仪（FACS）评估系统启动两步选择系统，该系统可以直接检测每个候选肽序列的“荧光变化”，将编码肽库的DNA引入质粒中以表达酵母表达，并将候选肽表达在酵母上，以使其表达在酵母上进行荧光修改。随后，通过FACS测量并收集单个荧光以选择选定的荧光。但是，内源性蛋白对细胞表面的影响大于预期，并且不可能选择S/N。因此，我们尝试构建一个在微粒表面修改DNA和肽的新系统。由于各种条件，两种类型的模型DNA被结合到分开的珠子，并将相应的肽固定在珠子上并成功分离。在后一种情况下，上一年的研究通常在构建一个系统的系统方面取得了成功，该系统选择了蛋白酶切割的肽序列。因此，今年我们进一步研究了这些条件，并实际从随机文库中选择了底物。结果，有效浓缩了与丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶进行酶反应的肽序列，并且可以通过下一代测序分析获得有关底物序列的知识。

项目成果

Development of Phenolphthalein Binding Peptide Aptamers Using cDNA Display

利用 cDNA 展示开发酚酞结合肽适体

• 发表时间: 2018
• 作者: Hiroki Anzai;Riku Yamada;Takuya Terai;Naoto Nemoto
• 通讯作者: Naoto Nemoto

進化分子工学を用いた有機小分子の構造変化を認識するペプチドアプタマーの開発

利用进化分子工程开发识别小有机分子结构变化的肽适体

• 发表时间: 2017
• 作者: 安齋宏紀;寺井琢也;根本直人
• 通讯作者: 根本直人

cDNA display法を用いた夾雑環境下での試験管内淘汰

使用cDNA展示法在污染环境中进行体外选择

• 发表时间: 2019
• 作者: 安齋 宏紀;根本 直人;寺井 琢也
• 通讯作者: 寺井 琢也

Improving the Solubility of Artificial Ligands of Streptavidin to Enable More Practical Reversible Switching of Protein Localization in Cells

• DOI: 10.1002/cbic.201600640
• 发表时间: 2017-02
• 期刊: ChemBioChem
• 影响因子: 3.2
• 作者: Ryo Tachibana;Takuya Terai;Gaelle Boncompain;S. Sugiyama;Nae Saito;F. Perez;Y. Urano

構造解析に基づく新規streptavidin結合分子の開発

基于结构分析开发新型链霉亲和素结合分子

• 发表时间: 2016
• 作者: 藤掛椋;寺井琢也;杉山成;浦野泰照
• 通讯作者: 浦野泰照