老化関連遺伝子SIRT1による神経細胞死抑制メカニズムの解析

衰老相关基因SIRT1抑制神经细胞死亡的机制分析

基本信息

批准号：
09J05137
负责人：
藤田幸
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J05137/
关键词：
SIRT1 zyxin 脱アセチル化 Yeast Two-Hybrid法アポトーシス NAD/NADH 核内移行シグナル免疫沈降法 NAD NADH

项目摘要

これまでに、SIRT1とzyxinがほ乳類細胞内で結合することを免疫沈降法により示したが、この実験系では、SIRT1,zyxin両者の結合が、直接結合であるか、細胞内因子などを介した間接的な結合によるのかについては定かではないnそこで、SIRT1とzyinが直接結合するか、in vitro pull-down assayにより検討した.大腸菌にGST-SIRT1またはHis-zyxin発現ベクターを導入し、Glutathione sepharoseまたはNi agaroseを用いてSIRT1、zyxinのタンパク質を精製することに成功した。また、zyxin deletion mutantとの結合を調べることにより、これまでに行った酵母での実験結果と同様に、zyxinのLIM domain3が、SIRT1との結合に必要であることを確認した。さらに、申請者は、中枢神経系におけるSIRT1の機能を詳細に調べるため、脳組織におけるSIRT1の発現分布について検討した。Real-TimePCR法、Western blot法により、RNAレベル、タンパク質レベルでの両者の発現を解析した結果、SIRT1,zyxinともにマウスの各臓器で発現していることを確認した。マウスの発生段階ごとの両者の発現レベルを比較した結果、各発現段階で両者ともに発現していた。また、in vivoでのSIRT1の機能を調べるため、SIRT1の発現をRNAiで抑制し、アポトーシス細胞の増減をTUNEL染色で検討したCoSIRT1の発現抑制のため、pSuper-GFPvectorにSIRT1のsiRNA配列を導入し、SIRT1shRNAベクターを作成した。in ovo electropolation法によりニワトリ胚網膜細胞に導入し、SIRT1の発現を抑制することを試みた。

到目前为止，我们通过免疫沉淀法证明了SIRT1和zyxin在哺乳动物细胞中结合，但在这个实验系统中，SIRT1和zyxin的结合要么是直接结合，要么是由细胞内因子介导的，目前还不清楚SIRT1和zyin是直接结合还是通过细胞内因子介导。是否是体外下拉所致我们通过测定法将 GST-SIRT1 或 His-zyxin 表达载体引入大肠杆菌中，并使用谷胱甘肽琼脂糖或 Ni 琼脂糖成功纯化了 SIRT1 和 zyxin 蛋白。此外，通过检查与 zyxin 缺失突变体的结合，我们证实了 zyxin 的 LIM 结构域 3 是与 SIRT1 结合所必需的，类似于之前在酵母中的实验结果。此外，为了详细研究SIRT1在中枢神经系统中的功能，申请人还研究了SIRT1在脑组织中的表达分布。使用实时PCR法和蛋白质印迹法分析RNA水平和蛋白质水平两者的表达，结果证实SIRT1和zyxin在小鼠的各器官中均表达。比较小鼠中各发育阶段两者的表达水平，结果发现两者在各表达阶段均表达。此外，为了研究SIRT1在体内的功能，我们通过RNAi抑制SIRT1的表达，并通过TUNEL染色检查凋亡细胞的增加或减少。为了抑制CoSIRT1的表达，我们将SIRT1 siRNA序列导入pSuper- GFP 载体，创建了 SIRT1shRNA 载体。我们尝试通过卵内电转将 SIRT1 引入鸡胚视网膜细胞中来抑制 SIRT1 的表达。

项目成果

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RGMa modulates T cell responses and is involved in autoimmune encephalom

RGMa 调节 T 细胞反应并参与自身免疫性脑病

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
82.9
作者：
Muramatsu; R.; Kubo; T.; Mori; M.; Nakamura; Y.; Fujita; Y.; Akutsu; T.; Okuno; T.; Taniguchi; J.; Kumanogoh; A.; Yoshida; M.; Mochizuki; H.; Kuwabara; S.; Yamashita; T.
通讯作者：
T.

Axotomy induces axonogenesis in hippocampal neurons through STAT3

轴切术通过 STAT3 诱导海马神经元轴突发生