Proposal and application of new microbial culture method focused on the headspace conditions of shake-flask

针对摇瓶顶空条件的微生物培养新方法的提出及应用

• 批准号: 16J00800
• 负责人: 高橋 将人
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J00800/
• 关键词: 振盪フラスコ培養; 二酸化炭素; 酸素; 集積培養; 純粋培養; モニタリング; サンプリング; 二酸化炭素換気; 二酸化炭素換気能

振盪培養中のフラスコ内の気相環境のガス成分の変化が、培養微生物群集や単一菌株に及ぼす影響はほとんど研究されておらず、未解明である。平成29年度は、申請者が発見した新奇な現象（振盪フラスコ培養中の間欠的な気相環境への操作が集積される培養微生物群集に影響を及ぼす）を対象に、平成28年度に実施した課題①【新奇な現象のメカニズムの解析】と課題②【単一菌を用いた振盪フラスコ培養法の解析】に対して詳細な解析を行い、課題③【Automatic Aeration Flask System（AAFS）の改良】を行い、以下の点を明らかにした。課題①に対して：従来法では、設定培養温度と同じ至適培養温度である微生物が優先化するが、振盪フラスコ培養中に間歇的な通気を行い一時的な溶存CO2濃度の低下をもたらすことで、至適培養温度が低い微生物が優先化することが明らかとなった。これらの微生物種は、本来の至適培養温度下と異なる性質を有することが示唆され、近年、改めて定義された微生物種が含まれていた。課題②に対して：坂口フラスコと三角フラスコを用いた振盪培養結果から、気相部のCO2を除去することで、従来法と比べてEscherichia coliの増殖が改善することが明らかとなった。また、Saccharomyces cerevisiaeの増殖は改善できなかったが、S. cerevisiaeを用いてフラスコ気相部のCO2濃度やO2濃度が鉛直方向に濃度勾配が形成していることを見出した。課題③に対して：予めCO2ガスと新鮮空気を混合ガス容器内に充填させ、コンプレッサーの代わりに混合ガス容器をAAFSに接続し、フラスコ気相部に一定速度で通気できる定速制御型と、コンプレッサーの代わりに純CO2ガスボンベをAAFSに接続し、フラスコ気相部への通気口の上流に設けた電磁弁とCDMSSをPID制御で接続した変速フィードバック型を開発した。

在奶昔培养过程中，烧瓶中气相环境的气体成分变化对培养的微生物群落和单菌株的影响几乎没有研究，但仍然未知。 In 2017, detailed analysis was conducted on the novel phenomena discovered by the applicant (influences on the cultured microbial community where intermittent gas-phase operations during shake flask culture have been achieved) in 2016, and detailed analysis was conducted on the 1st (analysis of novel phenomena mechanisms) and the 2nd (analysis of shake flask culture using a single bacteria), and the 3rd (improvement of the Automatic Aeration Flask System （AAFS））进行了，阐明了以下几点。关于问题1：在常规方法中，具有最佳培养温度的微生物作为设定培养温度的优先级，但是通过在奶昔培养过程中间歇性充气，已经表明，最佳培养温度较低的微生物将优先。这些微生物物种被认为具有与原始最佳培养温度下的微生物具有不同的特性，并且最近包括已定义的微生物物种。关于问题2：从使用Sakaguchi烧瓶和Erlenmeyer烧瓶的奶昔培养结果中，与常规方法相比，从气相中去除CO2可以改善大肠杆菌的生长。此外，尽管无法改善酿酒酵母的增殖，但发现使用酿酒酵母在烧瓶蒸气相截面的二氧化碳和O2浓度的垂直方向上形成了浓度梯度。关于挑战3：我们开发了一种恒定的控制类型，其中二氧化碳气体和新鲜空气被提前填充在混合气容器中，混合的气体容器与AAF相连而不是压缩机，并且恒定的速度控制类型允许空气以恒定的速度排放烧瓶蒸气相，并将纯二氧化碳旋转剂与AAFS连接到AFS，而不是压缩机，并且可以将压缩机和变量连接起来。通风口端口的上游到烧瓶蒸气相部分和CDMS与PID控制连接。

项目成果

Development of novel microbial culture system focused on the headspace of the shake flask

以摇瓶顶部空间为重点的新型微生物培养系统的开发

• 发表时间: 2016
• 作者: 青柳秀紀;高橋将人;斎藤涼;長谷川智弘;小林和輝;高野力;高橋 将人;Masato TAKAHASHI;高橋 将人;高橋 将人;Masato TAKAHASHI
• 通讯作者: Masato TAKAHASHI

Effect of intermittent opening of breathable culture plugs and aeration of headspace on the structure of microbial communities in shake-flask culture

间歇打开透气培养塞和顶部空间通气对摇瓶培养微生物群落结构的影响

• DOI: 10.1016/j.jbiosc.2018.01.009
• 发表时间: 2018
• 期刊: Journal of Bioscience and Bioengineering
• 影响因子: 2.8
• 作者: Takahashi Masato;Aoyagi Hideki
• 通讯作者: Aoyagi Hideki

Behavior analysis of CO2 and O2 in gas-liquid phases of shake flask during cultivation

培养过程中摇瓶气液相中CO2和O2的行为分析

• 发表时间: 2016
• 作者: 青柳秀紀;高橋将人;斎藤涼;長谷川智弘;小林和輝;高野力;高橋 将人;Masato TAKAHASHI
• 通讯作者: Masato TAKAHASHI

振盪フラスコ培養中の気相および液相のCO2とO2の挙動解析

摇瓶培养过程中 CO2 和 O2 在气相和液相中的行为分析

• 发表时间: 2016
• 作者: 青柳秀紀;高橋将人;斎藤涼;長谷川智弘;小林和輝;高野力;高橋 将人;Masato TAKAHASHI;高橋 将人
• 通讯作者: 高橋 将人

従来の微生物培養法の特性：問題点と解決策の提案

传统微生物培养方法的特点：问题及解决方案

• 发表时间: 2017
• 作者: 青柳秀紀;高橋将人;斎藤涼;長谷川智弘;小林和輝;高野力
• 通讯作者: 高野力