頂底極性決定因子CrumbsのmRNA局在化機構の解析

顶底极性决定子Crumbs的mRNA定位机制分析

• 批准号: 09J01309
• 负责人: 飯岡 英和
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J01309/
• 关键词: 頂底極性; 上皮細胞; Crumbs; 細胞極性; RNA; タンパク質; 培養細胞; 相互作用; RNA結合タンパク質

上皮細胞に見られる頂底極性は、細胞内で局在する頂底極性決定因子群の働きによって形成される。決定因子の一つCrumbs(Crb)タンパク質は細胞の頂部膜のみに局在し、さらに他の因子との相互作用や細胞骨格の再構成を介して頂底極性の調節・決定に寄与していると考えられる。近年ショウジョウバエ胚においてCrbがmRNAレベルで上皮細胞の頂部側に局在していることが報告された。mRNAレベルのタンパク質局在制御は出芽酵母、ショウジョウバエの生殖系列、哺乳類神経細胞などにおいて、細胞の運命決定や、機能制御に貢献していることが知られているが、哺乳類上皮細胞においてはこれまで知られていなかった。本研究ではCrb mRNAに結合するタンパク質を同定し、Crbの機能、及び、頂底極性の形成における役割を明らかにすることを目的とした。昨年度までに一次スクリーニングとしてRNA結合タンパク検出法を立ち上げた。今年度は、得られた候補タンパク質に対して網羅的にshRNAによるノックダウン実験を行った。その結果、IRSp53を平面培養した上皮細胞内でノックダウンしたところ、Crb mRNAの頂部局在が抑制された。このことはIRSp53がCrb mRNAの局在制御に役割を果たしていることを示唆している。これまでにIRSp53は細胞の突起形成やアクチン細胞骨格の再編成において機能することが報告されているが、RNAの制御に関与するという報告は皆無である。今後はRNA免疫沈降・細胞極性又はシスト形成の観察など、生化学的、細胞生物学的な実験を駆使して、更に詳細な機能解析を慎重に行う予定である。また今年度中にRNA結合タンパク質検出の方法論のみを論文にまとめ、Nucleic Acids Research誌に投稿し、受理された。

在上皮细胞中观察到的顶底极性是由一组细胞内局部顶底极性决定因子的作用形成的。 Crumbs (Crb) 蛋白是决定因素之一，仅定位于细胞的顶膜，并且通过与其他因素的相互作用和细胞骨架的重排进一步有助于调节和确定顶底极性。那。最近有报道称，果蝇胚胎中Crb在mRNA水平上定位于上皮细胞的顶端侧。已知mRNA水平上的蛋白质定位控制有助于出芽酵母、果蝇种系、哺乳动物神经细胞等的细胞命运决定和功能控制，但迄今为止在哺乳动物上皮细胞中尚未有报道。不为人知。本研究的目的是鉴定与 Crb mRNA 结合的蛋白质，并阐明 Crb 的功能及其在顶底极性形成中的作用。到去年，我们已经推出了 RNA 结合蛋白检测方法作为初步筛选。今年，我们利用shRNA对获得的候选蛋白进行了全面的敲低实验。结果，当IRSp53在扁平培养的上皮细胞中被敲低时，Crb mRNA的顶端定位被抑制。这表明IRSp53在调节Crb mRNA的定位中发挥作用。尽管已有报道IRSp53在细胞突起形成和肌动蛋白细胞骨架重组中发挥作用，但尚无其参与RNA调节的报道。未来，我们计划利用RNA免疫沉淀、观察细胞极性和囊肿形成等生化和细胞生物学实验，仔细进行更详细的功能分析。此外，在本财年，我们编写了一篇关于检测 RNA 结合蛋白的方法的论文，将其提交给 Nucleic Acids Research 并获得接受。

项目成果

Axon growth-stimulus package includes local translation

轴突生长刺激包包括本地翻译

• 发表时间: 2009
• 作者: Macara IG; Iioka H; Mili S
• 通讯作者: Mili S