新規阻害剤を用いた巨大ATPaseミダシンによるリボソーム生合成の制御機構の解明
使用新型抑制剂阐明巨型 ATP 酶米达辛对核糖体生物合成的控制机制
基本信息
- 批准号:15J09028
- 负责人:
- 金额:$ 2.83万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for JSPS Fellows
- 财政年份:2015
- 资助国家:日本
- 起止时间:2015-04-24 至 2018-03-31
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
本年度では、動的なリボソーム生合成の仕組みを高い時間分解能で解析するための化学遺伝学的な手法を学ぶため、米国ノースウェスタン大学のAli Shilatifard教授の研究室に客員研究員として約1年間参加した。高等動物において、RNAポリメラーゼII(Pol II)によるRNAの転写伸長はプロモーター近傍で一時停止する。この転写伸長の停止と解除は数分のオーダーで起きる動的な生命現象である。Pol IIに結合するPAF1タンパク質複合体は、この転写伸長の停止と解除の制御に関わる。しかしこれまでに、PAF1が転写伸長を停止させる、または転写伸長の停止を解除するという相反する結果が報告されている。これらの結論は、RNAiノックダウン法によるPAF1タンパク質の除去後の実験結果に基づく。ノックダウン法の欠点は、PAF1を細胞内から除去するのに数日を要し、その間に生じる二次的な影響を排除できない点にある。そこで、標的タンパク質を数時間のうちに細胞内から除去することが可能なオーキシンデグロン法を用いて、PAF1の機能を直接的に解析できるのかを検討した。ライスTIR1を恒常的に発現するヒトがん細胞DLD1において、Cas9を用いてPAF1遺伝子のC末端にAIDタグをホモに挿入した。このPAF1-AID細胞株を低分子化合物オーキシンで1時間処理したところ、90%以上のPAF1-AIDタンパク質が細胞内から除去された。この実験系を用いて、転写伸長の様子をPol II ChIP-seqにより観察したところ、オーキシンを添加して1時間後に、転写伸長の停止がゲノムワイドに解除されることがわかった。この結果は、PAF1複合体が直接的にプロモーター近傍での転写伸長を停止させることを示す。以上の結果を含む研究成果をScience誌に発表した。
今年,我参加了美国西北大学的Ali Shilatifard教授实验室的客座研究员大约一年,以了解化学遗传技术,以分析具有高时间分辨率的动态核糖体生物合成机制。在较高的动物中,RNA聚合酶II(POL II)的RNA转录伸长被悬浮在启动子附近。这种转录伸长停止和释放是一种动态的生命现象,在几分钟的时间内发生。与POL II结合的PAF1蛋白复合物参与调节该转录伸长的终止和释放。但是,到目前为止,已经报道了矛盾的结果,其中PAF1停止转录伸长或释放转录伸长。这些结论基于RNAi敲低方法去除PAF1蛋白后的实验结果。敲低方法的缺点是,从单元内删除PAF1需要几天,并且在此期间发生的次要效应无法消除。因此,我们研究了PAF1的功能是否可以使用生长素DEGRON方法直接分析,该方法允许在几个小时内从细胞内移除靶蛋白。在组成性表达水稻Tir1的人类癌细胞DLD1中,使用CAS9同源地插入了PAF1基因的C末端。该PAF1-AID细胞系用小分子生长素处理1小时,并从细胞中除去90%以上的PAF1-AID蛋白。使用该实验系统,使用POL II芯片序列观察到转录伸长,发现转录伸长在添加生长素后一小时被基因组释放出来。该结果表明,PAF1复合物直接阻止启动子附近的转录伸长。包括上述结果在内的研究结果已发表在《科学杂志》上。
项目成果
期刊论文数量(0)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Synthetic Chromatin Acylation by an Artificial Catalyst System
- DOI:10.1016/j.chempr.2017.04.002
- 发表时间:2017-06-08
- 期刊:
- 影响因子:23.5
- 作者:Ishiguro, Tadashi;Amamoto, Yoshifumi;Kanai, Motomu
- 通讯作者:Kanai, Motomu
Potent, Reversible, and Specific Chemical Inhibitors of Eukaryotic Ribosome Biogenesis.
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- 期刊:
- 影响因子:64.5
- 作者:Kawashima, Shigehiro A.;Chen, Zhen;Aoi, Yuki;Patgiri, Anupam;Kobayashi, Yuki;Nurse, Paul;Kapoor, Tarun M.
- 通讯作者:Kapoor, Tarun M.
Synthetic Posttranslational Modifications: Chemical Catalyst-Driven Regioselective Histone Acylation of Native Chromatin
- DOI:10.1021/jacs.7b02138
- 发表时间:2017-06-07
- 期刊:
- 影响因子:15
- 作者:Amamoto, Yoshifumi;Aoi, Yuki;Kanai, Motomu
- 通讯作者:Kanai, Motomu
PAF1 regulation of promoter-proximal pause release via enhancer activation.
- DOI:10.1126/science.aan3269
- 发表时间:2017-09-22
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:Chen FX;Xie P;Collings CK;Cao K;Aoi Y;Marshall SA;Rendleman EJ;Ugarenko M;Ozark PA;Zhang A;Shiekhattar R;Smith ER;Zhang MQ;Shilatifard A
- 通讯作者:Shilatifard A
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