新規阻害剤を用いた巨大ＡＴＰａｓｅミダシンによるリボソーム生合成の制御機構の解明

使用新型抑制剂阐明巨型 ATP 酶米达辛对核糖体生物合成的控制机制

• 批准号: 15J09028
• 负责人: 青井 勇樹
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J09028/
• 关键词: リボソーム; 化学遺伝学; オーキシンデグロン; リボソーム生合成; 阻害剤; ミダシン; ATPase

本年度では、動的なリボソーム生合成の仕組みを高い時間分解能で解析するための化学遺伝学的な手法を学ぶため、米国ノースウェスタン大学のAli Shilatifard教授の研究室に客員研究員として約1年間参加した。高等動物において、RNAポリメラーゼII（Pol II）によるRNAの転写伸長はプロモーター近傍で一時停止する。この転写伸長の停止と解除は数分のオーダーで起きる動的な生命現象である。Pol IIに結合するPAF1タンパク質複合体は、この転写伸長の停止と解除の制御に関わる。しかしこれまでに、PAF1が転写伸長を停止させる、または転写伸長の停止を解除するという相反する結果が報告されている。これらの結論は、RNAiノックダウン法によるPAF1タンパク質の除去後の実験結果に基づく。ノックダウン法の欠点は、PAF1を細胞内から除去するのに数日を要し、その間に生じる二次的な影響を排除できない点にある。そこで、標的タンパク質を数時間のうちに細胞内から除去することが可能なオーキシンデグロン法を用いて、PAF1の機能を直接的に解析できるのかを検討した。ライスTIR1を恒常的に発現するヒトがん細胞DLD1において、Cas9を用いてPAF1遺伝子のC末端にAIDタグをホモに挿入した。このPAF1-AID細胞株を低分子化合物オーキシンで1時間処理したところ、90％以上のPAF1-AIDタンパク質が細胞内から除去された。この実験系を用いて、転写伸長の様子をPol II ChIP-seqにより観察したところ、オーキシンを添加して1時間後に、転写伸長の停止がゲノムワイドに解除されることがわかった。この結果は、PAF1複合体が直接的にプロモーター近傍での転写伸長を停止させることを示す。以上の結果を含む研究成果をScience誌に発表した。

今年，我作为访问研究员在美国西北大学Ali Shilatifard教授实验室进行了大约一年的学习，学习化学遗传学方法来分析高时间分辨率的动态核糖体生物发生机制。在高等动物中，RNA 聚合酶 II (Pol II) 的 RNA 转录延伸在启动子附近暂停。转录延伸的终止和释放是一种动态的生物现象，发生时间约为几分钟。与 Pol II 结合的 PAF1 蛋白复合物参与调节转录延伸的终止和释放。然而，迄今为止报道的结果相互矛盾，表明 PAF1 要么停止转录延伸，要么释放转录延伸的抑制。这些结论是基于RNAi敲低方法去除PAF1蛋白后的实验结果。敲低方法的缺点是需要几天的时间才能从细胞中去除PAF1，并且不能排除在此期间发生的副作用。因此，我们研究是否可以使用生长素降解决定子方法直接分析PAF1的功能，该方法可以在几个小时内将目标蛋白从细胞中去除。在组成型表达水稻TIR1的人癌细胞DLD1中，使用Cas9将AID标签均匀插入PAF1基因的C末端。当用低分子复合生长素处理该PAF1-AID细胞系1小时时，90%以上的PAF1-AID蛋白从细胞内部被去除。使用该实验系统，我们通过 Pol II ChIP-seq 观察了转录延伸，发现添加生长素 1 小时后，全基因组范围内释放了转录延伸停滞。该结果表明PAF1复合物直接阻止启动子附近的转录延伸。包括上述结果在内的研究成果发表在《Science》杂志上。

项目成果

ロックフェラー大学(米国)

洛克菲勒大学（美国）

Synthetic Chromatin Acylation by an Artificial Catalyst System

• DOI: 10.1016/j.chempr.2017.04.002
• 发表时间: 2017-06-08
• 期刊: CHEM
• 影响因子: 23.5
• 作者: Ishiguro, Tadashi;Amamoto, Yoshifumi;Kanai, Motomu
• 通讯作者: Kanai, Motomu

Potent, Reversible, and Specific Chemical Inhibitors of Eukaryotic Ribosome Biogenesis.

• DOI: 10.1016/j.cell.2016.08.070
• 发表时间: 2016-10-06
• 期刊: CELL
• 影响因子: 64.5
• 作者: Kawashima, Shigehiro A.;Chen, Zhen;Aoi, Yuki;Patgiri, Anupam;Kobayashi, Yuki;Nurse, Paul;Kapoor, Tarun M.
• 通讯作者: Kapoor, Tarun M.

Synthetic Posttranslational Modifications: Chemical Catalyst-Driven Regioselective Histone Acylation of Native Chromatin

• DOI: 10.1021/jacs.7b02138
• 发表时间: 2017-06-07
• 期刊: JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
• 影响因子: 15
• 作者: Amamoto, Yoshifumi;Aoi, Yuki;Kanai, Motomu
• 通讯作者: Kanai, Motomu

PAF1 regulation of promoter-proximal pause release via enhancer activation.

• DOI: 10.1126/science.aan3269
• 发表时间: 2017-09-22
• 期刊: Science (New York, N.Y.)
• 作者: Chen FX;Xie P;Collings CK;Cao K;Aoi Y;Marshall SA;Rendleman EJ;Ugarenko M;Ozark PA;Zhang A;Shiekhattar R;Smith ER;Zhang MQ;Shilatifard A
• 通讯作者: Shilatifard A