Development of a detection system for epigenetic modifications using enzyme fused zinc finger protein

使用酶融合锌指蛋白开发表观遗传修饰检测系统

基本信息

批准号：
15J08615
负责人：
李鎭煕
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究ではDNAのメチル化を始めとするエピジェネティック修飾を、がんをはじめとする種々の疾患の早期・術中診断の指標として利用することを想定し、アルカリフォスファターゼ融合ジンクフィンガー蛋白質（ALP融合ZFP）の開発、及びそれを用いた検出システムの開発を目的とし、研究を行った。平成29年度は、ALP融合ZFPを用いた種々の標的DNA検出システムの構築を行った。まず、ALP融合ZFPによって標的のDNAを検出できるかをプレートアッセイによって確かめた。標的DNAのモデルである大腸菌O157のゲノムDNAを検出したところ、標的DNAの濃度に依存してシグナルが上昇し、10コピーの感度から検出することができた。一方で、標的ではないサルモネラ菌のゲノムDNAを検出した際にはシグナルの上昇が観察されなかったことから特異性にも優れた検出法であることが示された。また、小型で高感度な標的DNAの検出系を構築するため、チップ電極を用いた標的DNAの電気化学的な検出システムの開発も行った。ここではプレートではなくアビジンビーズ上に標的DNAを固定しALP融合ZFPによる検出を行った。ビーズと基質であるp-aminophenyl phosphateを混合し、酵素反応によって生じる反応生成物をチップ電極上で検出することで、電気化学的に標的DNAの検出を行った。結果として、グルコース脱水素酵素を用いた場合よりも100倍程度高感度に標的DNAを検出することができた。以上本年度は、ALPを融合したZFPを用いて化学発光、または電気化学的なシグナルに基づく標的DNAの検出システムの構築を行った。昨年度Biosensors and Bioelectronics誌に報告したDNAのメチル化検出法と、本検出法を組み合わせることで、より高感度なDNAメチル化の検出が期待できる。

这项研究旨在使用包括DNA甲基化在内的表观遗传修饰，作为包括癌症在内的各种疾病的早期和术中诊断的指标，并旨在开发碱性磷酸酶融合锌指蛋白（ALP融合ZFP）和使用IT的检测系统。 2017年，使用ALP融合ZFP构建了各种靶DNA检测系统。首先，通过板测定确认了是否可以通过ALP融合ZFP检测到靶DNA。当靶DNA模型大肠杆菌O157的基因组DNA时，信号会根据靶DNA的浓度增加而增加，并且可以从10份拷贝的灵敏度中检测到它。另一方面，当检测到非靶向沙门氏菌细菌的基因组DNA时，未观察到信号，表明这种检测方法具有良好的特异性。此外，为了构建一个高度敏感的目标DNA检测系统，我们还使用芯片电极开发了用于靶DNA的电化学检测系统。在这里，靶DNA固定在Avidin珠而不是板上，并由ALP融合的ZFP检测到。将珠与底物P-氨基哲学磷酸盐混合，并在芯片电极上检测到由酶反应产生的反应产物，从而从化学上检测到靶DNA。结果，可以使用葡萄糖脱氢酶高约100倍的灵敏度检测到靶DNA。在今年，我们使用与ALP融合的ZFP建立了基于化学发光或电化学信号的靶DNA检测系统。通过将这种检测方法与去年在生物传感器和生物电子药物中报道的DNA甲基化检测方法相结合，可以预期这种检测方法可提供对DNA甲基化的更敏感的检测。