オプトジェネティクスを用いたＨｅｓ１の発現振動による細胞周期制御メカニズムの解明

利用光遗传学阐明Hes1表达振荡的细胞周期控制机制

• 批准号: 15J06195
• 负责人: 前田 勇樹
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J06195/
• 关键词: 発現動態; GAVPO; 光制御; CRISPR-Cas9システム; Hes1; 発現振動; 細胞周期

昨年度は、光で人工的にHes1の発現動態（Hes1の発現なし、発現振動、持続発現）を誘導する系をHes1欠損型(KO)マウス由来のマウス胎児繊維芽細胞(MEF)に導入し、解析したが、適切な系ではなかったため、違う培養細胞の検討を行った。今年度はその培養細胞の検討から行った。昨年度CRISSPR-Cas9システムによるHes1 KOの誘導は高効率でできたので、その系を用いて10T1/2,及びC2C12にHes1KOを誘導したところ、増殖の減少は確認できなかった。次にCreによるHes1flox MEF のHes1 KO誘導に関して検討した。昨年度はCreによって効率よくHes1 KOを誘導できなかったため、条件の検討やCre発現系の改良を行い、高効率でのHes1 KOの誘導に成功した。そこで、Hes1 flox MEFにHes1 KOを誘導したところ、増殖の減少は確認できなかった。次に神経幹細胞の培養系の使用を検討した。Hes1 flox Hes3/Hes5/Hey1トリプルノックアウトマウスから樹立した神経幹細胞にCreによるHes1の欠損を誘導したところ、増殖速度が減少することが分かった。そこでこの細胞を用いてHes1の発現振動による細胞周期制御メカニズムの解明を目指した。まず、Hes1の欠損による下流因子の発現の変化があるか調べたところ、神経分化関連因子であるascl1や細胞周期制御関連因子であるGadd45gなどの発現がHes1の欠損によって上昇していることが分かった。次に、光応答性転写因子GAVPOによって人工的にHes1の発現振動の誘導を試みたところ、2.5時間周期、3時間周期での発現振動の誘導に成功した。そこでHes1野生型の神経幹細胞にHes1の発現振動を2.5時間周期、3時間周期を誘導したところ増殖速度が促進された

去年，将Hes1（无表达，振荡，持续表达）的人为诱导的系统引入了HES1缺陷型（KO）小鼠并分析的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFS）中，但该系统不是适当的培养细胞，因此检查了不同的系统，因此被检查了。今年，我们首先检查了培养的细胞。由于去年Crisspr-Cas9系统诱导HES1 KO非常有效，因此我们使用该系统在10T1/2和C2C12诱导HES1KO，并且没有证实增殖的降低。接下来，我们研究了CRE的Hes1flox MEF中HES1 KO的诱导。去年，CRE无法有效诱导HES1 KO，因此我们研究了条件并改善了CRE表达系统，并以高效率成功诱导了HES1 KO。因此，当在Hes1 Flox MEF中诱导Hes1 KO时，没有确认增殖的减少。接下来，检查了神经干细胞培养系统的使用。我们发现，Cre诱导的HES1缺乏在HES1 FLOX HES3/HES5/HEY1三重敲除小鼠中建立的神经干细胞中的缺乏，从而降低了增殖速率。因此，我们旨在使用这些细胞通过HES1表达振荡来阐明细胞周期调节的机理。首先，当我们研究由于HES1缺乏引起的下游因子的表达是否发生变化时，我们发现ASCL1的表达，与神经分化相关的因子和GADD45G（细胞周期调控因子）的表达增加了，而与细胞周期相关的因子则增加了HES1缺乏症。接下来，当试图在2.5小时周期和3小时周期中人为地诱导HES1表达振荡的人为振荡时，成功诱导了振荡。因此，HES1表达振荡在HES1野生型神经干细胞中诱导2.5小时3小时，并增加了生长速度。

项目成果

オプトジェネティクスを用いたHes1の発現振動による細胞周期制御メカニズムの解析

利用光遗传学分析Hes1表达振荡的细胞周期控制机制

• 发表时间: 2017
• 作者: 前田 勇樹