ｃ－Ｍｙｂ　ＤＮＡ結合ドメインの機能に着目した生物学的揺らぎの多角的解析

关注c-Myb DNA结合域功能的生物波动的多方面分析

基本信息

批准号：
15J03576
负责人：
稲葉理美
金额：
$ 1.68万
依托单位：
Kyoto Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J03576/
关键词：
熱力学量構造揺らぎ

项目摘要

2016年度は、前年度にNMRや熱測定で得られたc-Myb DNA結合ドメインに関する知見をさらに多角的に評価するべく、1分子解析や高圧下での研究を進めた。1分子解析は、SPring-8の高輝度X線を用いた時分割測定（DXT）を適用し、DNA結合に伴う運動性変化をミリ秒～マイクロ秒で追跡した。測定にあたり、変異体の作製やプローブのラベル部位などの検討も進め、1分子系のアンサンブル量の運動性変化と多分子系での揺らぎの情報がよく相関することを明らかにした。加えて、DNA結合状態での揺らぎの減少が認められ、これはITCやDSCで得られたエントロピー変化量の結果と相関することも明らかとなった。高圧解析では、ダイアモンドアンビルセルを用いて、1 GPaを超える圧力まで測定することで、圧力軸での安定性の差異を明らかにすることに成功した。対象タンパク質の変性圧力中間点は約800 MPaであり、蛍光やNMR測定条件下においてはフォールド構造内の揺らぎを検出可能であることも示した。また、変異体を用いた実験により、タンパク質内部のキャビティと部分モル体積変化（ΔV）との間に良い相関を見出した。これらの結果は、これまでの温度変化やpH変化により得られた揺らぎの情報とも一致する。現在、双方ともに論文執筆中である。さらに、リピート間の構造安定性に着目した研究も進め、c-MybがDNA結合に2つのリピートが必須である裏付けをフォールディングに関わる熱力学量により実証した。

2016年，我们开展了高压下的单分子分析研究，以进一步从多个角度评估前一年通过NMR和热测量获得的c-Myb DNA结合结构域的知识。对于单分子分析，采用了在 SPring-8 上使用高亮度 X 射线的分时测量 (DXT)，并在毫秒到微秒内跟踪与 DNA 结合相关的运动变化。在测量过程中，我们还研究了突变体的产生和探针的标记位点，发现单分子系统中整体量迁移率的变化与多分子系统中的波动信息有很好的相关性。分子系统。此外，还观察到DNA结合状态的波动减少，并且还揭示了这与ITC和DSC获得的熵变结果相关。在高压分析中，我们通过使用金刚石砧池测量超过 1 GPa 的压力，成功地阐明了沿压力轴的稳定性差异。还表明目标蛋白的变性压力的中点约为800MPa，并且在荧光和NMR测量条件下可以检测到折叠结构内的波动。此外，通过使用突变体的实验，我们发现蛋白质的内腔与偏摩尔体积（ΔV）的变化之间存在良好的相关性。这些结果与之前因温度和 pH 值变化而获得的波动信息一致。两位作者目前正在撰写论文。此外，我们还针对重复之间的结构稳定性进行了研究，并利用与折叠相关的热力学量证明了两个重复对于 c-Myb 中的 DNA 结合至关重要。