細胞周期制御因子とトランスポゾンの組合せによる高品質なブタｉＰＳ細胞の樹立

结合细胞周期调控因子和转座子建立高质量猪iPS细胞

基本信息

批准号：
15J02085
负责人：
土内憲一郎
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒト由来の細胞周期制御因子である、変異型CDK4、Cyclin D、TERTの導入によって樹立したブタ不死化細胞とその元となった初代線維芽細胞を用いて、ブタiPS細胞の樹立およびその効率・品質を向上させる研究を行ってきた。この両細胞を用いた実験によって、山中4因子に、細胞の初期化からの後戻りを防ぐのに効果があるといわれるLin28遺伝子と多能性幹細胞の最も重要なマーカーの１つであるNanog遺伝子を加えた計6因子での導入が効果的であることを突き止めた。さらに、Nanog同様多能性を示すマーカーであるOct3/4の上流に、MyoD遺伝子に由来するTransactivation domain (TAD)を連結した改変6因子ベクターの作製・利用により、未分化状態が維持しやすく形態の良い（ = 品質の良い）細胞株が得られることがわかった。4因子誘導株と6因子誘導株の間に存在する樹立効率以外の差が明らかでなかったため、当研究グループの樹立した6因子由来ブタiPS細胞株と既報の4因子株の間で次世代シークエンサーを用いたRNA-Seq解析を行い、遺伝子発現レベルでの差を明らかにすることを試みた。その結果、6因子誘導株は4因子誘導株と比較して、naive型（ = より分化能が高く生殖細胞やキメラ個体への寄与能力があるとされる）の特徴とされる遺伝子群が有意に発現上昇していることがわかった。この遺伝子の中には、マウスやラットのES/iPS細胞において高発現していおり、現在Naive型特異的な遺伝子と知られるものが複数含まれていた。このデータから、ブタにおいて誘導因子の数を増やすことで樹立効率だけでなく樹立した細胞の質を向上させることができることを遺伝子発現レベルで証明できたと考えている。現在上記関連データをまとめ論文を投稿中である。

我们使用通过引入突变型CDK4、Cyclin D和TERT（人类来源的细胞周期调节剂）以及它们来源的原代成纤维细胞而建立的永生化猪细胞，建立了猪iPS细胞及其效率和效率。提高质量。通过使用这两种类型的细胞进行实验，我们发现山中四核细胞中添加了据称可有效防止细胞重编程逆转的Lin28基因和多能干细胞最重要的标记之一Nanog基因。我们发现总共引入六个因素是有效的。此外，通过创建并使用修饰的六因子载体，其中来自MyoD基因的反式激活结构域（TAD）连接在Oct3/4的上游，Oct3/4是与Nanog一样指示多能性的标记，可以容易地维持未分化状态，发现可以容易地维持形态学（=良好质量）的细胞系。由于4因子和6因子衍生菌株之间除建立效率外没有明显差异，因此使用下一代测序仪将我们研究组建立的6因子衍生猪iPS细胞系与之前报道的进行比较我们使用这种方法进行了 4 因子菌株的 RNA 测序分析，并试图阐明基因表达水平的差异。结果，与4因子衍生菌株相比，6因子衍生菌株显示出幼稚型特征的显着基因簇（=更高的分化能力和对生殖细胞和嵌合个体的贡献能力）。发现表达增加。这些基因包括在小鼠和大鼠 ES/iPS 细胞中高度表达的多个基因，目前已知是幼稚类型特异性基因。从这些数据中，我们相信我们已经能够在基因表达水平上证明，增加猪体内诱导剂的数量不仅可以提高建立效率，还可以提高建立细胞的质量。目前我们正在整理上述相关数据并提交论文。