染色体複製制御に関わるInitiator Titration機構の解明

阐明染色体复制控制中涉及的引发剂滴定机制

基本信息

批准号：
20570164
负责人：
小川徹
金额：
$ 3.08万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20570164/
关键词：
DNA複製 DnaA 大腸菌蛍光タンパク質

项目摘要

複製開始反応は細胞周期の決まった時期に1回だけ起きるように厳密に制御されている。本研究では大腸菌細胞周期における複製開始タンパク質DnaAの挙動を解明する目的で以下の研究を行った。(1)細胞周期におけるDnaAタンパク質の細胞内局在DnaAの挙動を生細胞内で観察することはこれまで世界各地で試みられていたが困難であった。我々は、ドメインIIの生育に必須でない配列を同定し、その一部分をEYFPと置換することにより初めて観察に成功した。DnaA-EYFP発現株の解析から、DnaAは、これまでの報告と異なって核様体DNA上に存在しており、しかもかなりの部分はDNA上の限られた部位に集合していることを見いだした。さらに、この集合体が細胞周期を通じて複製起点oriCとInitiator titrationに関わる部位datAの間をダイナミックに行き来していることが示唆された。(2)DnaAタンパク質の細胞内局在を制御する因子の同定複製を正に制御することが知られているDiaAの欠失下では、複製開始時の細胞でDnaA-EYFP集合体の形成が著しく低下していた。DnaAのoriCへの集合にDiaAが関わっていることが示された。一方、複製を負に制御することが知られているSeqAの欠失下では、複製開始時の細胞でDnaA-EYFP集合体の数が著しく増加していた。SeqAがDnaAのoriCへの集合を阻害していることをビジュアルに示すことが出来た。また、IHFおよびFISがDnaA-EYFP集合体形成の時期と効率の制御に関わっていることが判明した。

复制起始反应受到严格控制，因此仅在细胞周期的固定阶段发生一次。在本研究中，我们进行了以下研究来阐明复制起始蛋白 DnaA 在大肠杆菌细胞周期中的行为。 (1)细胞周期中DnaA蛋白的细胞内定位世界许多地方都尝试过观察活细胞中DnaA的行为，但一直很困难。我们通过鉴定结构域 II 中对生长不重要的序列并用 EYFP 替换其中的一部分，首次成功地进行了这一观察。通过对 DnaA-EYFP 表达菌株的分析，我们发现 DnaA 存在于类核 DNA 上，与之前的报道不同，并且其中相当一部分聚集在 DNA 的有限位点上。此外，有人认为，在整个细胞周期中，该组装体在复制起点 oriC 和起始滴定位点 datA 之间动态地来回移动。 (2)控制DnaA蛋白细胞内定位的因素的鉴定在已知正调节复制的DiaA缺失中，复制开始时细胞内DnaA-EYFP聚集体的形成显着减少。 DiaA 被证明参与 DnaA 组装成 oriC。另一方面，当已知负调节复制的SeqA被删除时，复制开始时细胞中DnaA-EYFP聚集体的数量显着增加。我们能够直观地证明 SeqA 抑制 DNAA 组装成 oriC。我们还发现 IHF 和 FIS 参与控制 DnaA-EYFP 组装形成的时间和效率。