再生医療プロセスのための遺伝子工学的手法による磁気細胞操作法の開発

利用基因工程技术开发磁性细胞操纵方法用于再生医学过程

• 批准号: 14J04488
• 负责人: 山口 雅紀
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-25 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J04488/
• 关键词: 組織工学; 生物・生体工学; 機能性磁性ナノ粒子; バイオ磁石

本研究室では再生医療プロセスへの応用を目指して、機能性磁性ナノ粒子と磁力を用いたティッシュエンジニアリング技術の開発を行っている。現在までに、機能性磁性ナノ粒子を細胞培養培地に添加することで、目的細胞の磁気分離法の開発、磁力を用いた三次元組織の構築法の開発に成功している。本研究では、細胞内に取り込まれた鉄イオンを貯蔵し、細胞内に磁性粒子を形成する性質を有したフェリチンタンパク質に着目し、細胞内にフェリチンを発現させることによって機能性磁性ナノ粒子を添加することなく磁力で細胞を操作できる新しい再生医療プロセス開発に取り組んだ。まず、構成的発現CMVプロモーター下にフェリチン遺伝子を配置したレンチウイルスベクターを作製し、フェリチン遺伝子を大量発現する安定発現細胞株を取得した。抗フェリチン抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果、安定発現株は十分にフェリチンを生成していることがわかった。次に、鉄イオントランスポーターであるDMT1遺伝子を細胞に発現させることで細胞内での磁性粒子の形成促進を試みた。構成的発現CMVプロモーター下にDMT1遺伝子を配置したプラスミドスベクターをフェリチン遺伝子安定発現株に遺伝子導入後、硫酸鉄(II)アンモニウムを添加した培地で2日間培養したところ、磁性粒子が形成されている（1.76 pg/cell）ことを確認した。硫酸鉄(II)アンモニウムは細胞毒性を示したため、硫酸鉄(II)アンモニウムに代わる新たな鉄イオン供給剤として、クエン酸鉄アンモニウム、トランスフェリンおよびアスコルビン酸を添加した培地で2日間培養することで、細胞毒性がほとんどなく細胞内に磁性粒子が形成されることがわかった（2.72 pg/cell）。今後は、細胞内での磁性微粒子形成のための更なる条件の最適化を行い、磁力による新しい再生医療のための組織工学技術の開発を行う予定である。

该实验室正在使用功能性磁性纳米颗粒和磁力开发组织工程技术，目的是应用于再生医学过程。迄今为止，通过将功能性磁性纳米颗粒添加到细胞培养基中，我们成功地开发了一种磁分离的方法，并使用一种使用磁力来构建三维组织的方法。在这项研究中，我们专注于铁蛋白蛋白，该蛋白存储在细胞内部吸收的铁离子并在细胞内形成磁性颗粒，并致力于开发一种新的再生医学过程，该过程允许通过磁力操纵细胞，而不会通过在细胞内表达铁蛋白，而不会添加功能性磁性纳米颗粒。首先，制备了慢病毒载体，其中将铁蛋白基因放置在组成型表达的CMV启动子下，并获得了表达大量铁蛋白基因的稳定表达细胞系。使用抗铁蛋白抗体的蛋白质印迹显示，稳定的表达菌株很好地产生了铁蛋白。接下来，我们试图通过在细胞中表达铁离子转运蛋白DMT1基因来促进细胞内的磁颗粒的形成。将含有DMT1基因的质粒载体引入CMV启动子下的含有DMT1基因的菌株中，并在补充硫酸铵（II）硫酸铵（II）的培养基中培养2天，并确认已形成了磁性颗粒（1.76 pg/Cell）。由于铁（II）硫酸盐是细胞毒性的，因此发现在补充柠檬酸铵，转铁蛋白和抗坏血酸的培养基中培养在细胞毒性的细胞中形成的磁颗粒（2.72 pg/细胞），作为新的铁离子供应，以代替2天的硫酸盐硫酸盐（II）硫酸盐（II）2天。将来，我们计划进一步优化细胞内磁性颗粒形成的条件，并使用磁力开发用于新再生医学的组织工程技术。