ＳＫＩＰによるリソソームとリソソーム関連オルガネラの選択的輸送メカニズムの解明

通过SKIP阐明溶酶体和溶酶体相关细胞器的选择性转运机制

基本信息

批准号：
14J02630
负责人：
石田森衛
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

報告者は先行研究で、メラノソームの微小管順行性輸送の制御因子であるkinesin-1の欠損によりメラノソームが核周辺に凝集することを明らかにしている。そこでまず、マウスに存在する全43種類のKif分子に対するsiRNAを作成し、メラノソームの凝集が誘導されるものを網羅的にスクリーニングし、複数種の候補Kif分子を同定した。次にこれら結果のオフターゲット効果の可能性を検証するためにsiRNAのターゲットサイトをさらに3本増やし、またsiRNAの処理により実際mRNAの量が低下していることをRT-PCRにより検証を行った。これらの一連のスクリーニングの結果Kif1cという機能未知の分子を同定することに成功した。Kif1cのメラノソーム輸送への関与については証明されなかったが、これらの実験の過程でKif1cのtailドメインがメラノソーム特異的に局在することを発見した。さらに興味深いことに精製したKif1cのtailドメインを固定したメラノサイトと反応させると細胞に発現させた時と同様に、メラノソームに局在した。このことからKif1cのtailドメインが新規のメラノソーム特異的マーカーとして機能することが示唆された。さらに詳細な解析の結果、Kif1cのtailドメインはメラノソームの内腔部分であるメラノコアを直接認識していることが判明した。そこでKif1cのtailドメインを”M-INK (Melanosome INteracting Kif1c)”と名付け、このツールを利用した細胞染色への応用を行った。興味深いことにM-INKはこれまで染色が難しかったケラチノサイト内に転移されたメラノソームも認識した。

记者在预测中指出，驱动蛋白-1的缺陷是黑色素躯体显微镜转运的控制因子，导致黑色素体周围聚集在细胞核周围。因此，我们首先为小鼠中存在的所有43种KIF分子创建了siRNA，一般筛选了黑色素体的聚集，并鉴定了多种类型的候选KIF分子。接下来，RT-PCR验证了三个siRNA目标位点以检查这些结果的靶向效应的可能性，并且由于siRNA处理，mRNA的量实际上减少了。由于这些系列筛选，我们成功地识别了KIF1C的未知分子。尽管KIF1C参与Melano的某些运输未得到证明，但他发现KIF1C的尾巴域特定在这些实验过程中定位。更有趣的是，它位于黑色素体中，就好像它在细胞中与KIF1C尾域的黑色素细胞反应时一样在细胞中表达。这表明KIF1C的尾部结构域是一种新的黑色素体特异性标记。此外，一项详细的分析表明，KIF1C的尾部结构域直接识别出黑色素的内部口服部分Melanocore。因此，KIF1C的尾部结构域称为“ M-INK（黑色素体相互作用KIF1C）”，并使用此工具应用于细胞染色。有趣的是，M-Ink还认识到已转移到角质形成细胞的黑素体，到目前为止很难染色。