組織標本上での遺伝子特定部位のメチル化シトシンin situ検出法の開発

组织标本特定基因位点甲基化胞嘧啶原位检测方法的建立

基本信息

批准号：
19659086
负责人：
北澤荘平
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19659086/
关键词：
組織標本メチル化シトシン遺伝子プロモータ in situ hybridization

项目摘要

単一の受精卵に由来しながら、神経細胞から皮膚に至る多種多様な組織細胞分化が起こるメカニズムには。エピジェネティクス制御が重要とされている。メチル化シトシンは、エピジェネティクス制御機構の主体をなすDNA修飾であり、組織細胞分化や再生医療のみならず、腫瘍発生・進展においても重要である。特に、癌の個性に応じた薬物療法として、近年ではDNAメチル化阻害剤の適応について検索する手法が重要となる。私どもは、対象遺伝子の調節領域に存在するCpG-islandのシトシンメチル化を、細胞や組織の形態を維持したまま、in situで検出する組織化学的方法の開発についての検討を行った。本年度は、部位特異的DNAメチル化に対して、メチル化シトシンとオスミウム酸により錯体形成するICONプローブ(bipyridine-adenine標識プローブ)に着目し、染色体上で標的DNAとICONプローブとを結合させて、強固な化学結合で固定し、このICONプローブをもとに染色体上でPRINS法を行う実験系を構築することを目指して予検討を行った。染色体上でICONプローブをもとにPCR反応を行う際に、標識化合物を取り込ませた後、標識化合物に対する免疫組織化学にてシグナルを検出する。特異的で高感度のプローブ結合やPCR反応、メチル化シトシン-標識グアニン複合体に対する単クローン抗体の作成が課題となる。本年度は、単クローン抗体作成法の予検討と、染色体標本上でのPRINS法施行についての検討を行った。特に、標本の固定やheat denatureの条件設定や、標本上でのDNA合成進展に最適な酵素試薬の検定などを施行した。効率的なマウス免疫方法や、脾臓リンパ球回収、ミエローマ細胞との細胞融合、HAT培地による選択培養については、最適な実験系を整備することが出来た。

细胞分化成从神经细胞到皮肤等多种组织的机制源自单个受精卵。表观遗传控制被认为很重要。甲基化胞嘧啶是一种DNA修饰，在表观遗传学控制机制中发挥着核心作用，不仅在组织细胞分化和再生医学中很重要，而且在肿瘤的发生和进展中也很重要。近年来，作为针对癌症个体的药物治疗，寻找DNA甲基化抑制剂的适用性的方法变得尤为重要。我们研究了组织化学方法的发展，该方法可原位检测靶基因调控区域中 CpG 岛的胞嘧啶甲基化，同时保持细胞和组织的形态。今年，针对位点特异性DNA甲基化，我们重点研究了ICON探针（联吡啶-腺嘌呤标记探针），它与甲基化胞嘧啶和锇酸形成复合物，并将目标DNA与ICON探针连接在染色体上进行了初步研究。进行的目的是构建一个实验系统，以基于这种用强化学键固定的 ICON 探针对染色体进行 PRINS 方法。当基于ICON探针对染色体进行PCR反应时，标记化合物被掺入，然后通过免疫组织化学检测标记化合物的信号。挑战包括特异性和灵敏的探针结合、PCR 反应以及针对甲基化胞嘧啶标记的鸟嘌呤复合物的单克隆抗体的创建。今年，我们对单克隆抗体的生产方法以及PRINS方法在染色体标本上的实施进行了初步研究。特别是，我们设定了样本固定和热变性的条件，并测试了最适合样本 DNA 合成的酶试剂。我们能够开发最佳的实验系统，用于有效的小鼠免疫、脾淋巴细胞的收集、与骨髓瘤细胞的细胞融合以及使用 HAT 培养基的选择性培养。