Elucidation of Molecular basis of inherited and acquired protein S deficiency as a thrombosis risk factor

阐明遗传性和获得性蛋白质 S 缺乏作为血栓形成危险因素的分子基础

基本信息

批准号：
19590553
负责人：
KOJIMA Tetsuhito
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

先天性プロテインS(PS)欠損症・異常症の遺伝子解析において、未解析の新たな症例検体については従来のPCRダイレクトシーケンス法を用いた遺伝子変異の同定を行った結果、新規変異を含めてその原因と思われるPROS1遺伝子変異を同定した。その中でPROS1遺伝子の蛋白翻訳領域には変異は見つからなかったものの、翻訳開始点より168bp上流のプロモーター領域に同定したC→T (c.-168C>T)の点突然変異のルシフェラーゼ・レポーター解析の結果、変異型では転写活性が20%まで低下し、先天性PS欠損症の原因と思われた。先天性PS欠損症症例で従来の各エクソンのPCRダイレクトシーケンス法にてPROS1遺伝子に変異の見つからなかった症例において、PROS1遺伝子の15個の各エクソン部に偽遺伝子と区別するPCRプライマーを設定し、Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) 法によってPROS1遺伝子欠失の同定解析を行ったところ、PROS1遺伝子の全欠失を示す症例を1例同定した。しかし、他の多くの症例では欠失を同定できず、遺伝子欠失の頻度はまれであると思われた。ヒトPSを産生するHepG2 細胞を用い、エストラディオール(E2)の添加による培養上清中のPS分泌量の変動についてELISA 解析を行ったところ、30%の発現低下を認めた。また、細胞内PS mRNAの変動についてReal Time PCRを用いて定量した結果、同様にE2 の添加によるmRNA発現低下を認めた。現在、PS遺伝子プロモータ領域をクローニングし、ルシフェラーゼ・レポーター解析による、HepG2細胞でのE2 によるPS遺伝子発現の制御動態解析を施行中である。

在先天性蛋白 S (PS) 缺乏和异常的遗传分析中，我们使用传统 PCR 直接测序在未分析的新病例样本中发现了基因突变，其中包括 PROS1 基因中的新突变，这似乎是原因。尽管在 PROS1 基因的蛋白质翻译区中没有发现突变，但荧光素酶报告基因分析在翻译起始位点上游 168 bp 的启动子区中发现了 C→T (c.-168C>T) 点突变。结果，突变型的转录活性降低了20%，这被认为是先天性PS缺陷的原因。在先天性PS缺陷的情况下，使用常规PCR直接测序各外显子未发现PROS1基因突变，则在PROS1基因的15个外显子中的每一个中设置PCR引物，以将其与假基因区分开。使用多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 方法进行鉴定和分析，鉴定出 1 例 PROS1 基因完全缺失的病例。然而，在许多其他情况下，无法识别出缺失，并且基因缺失的频率似乎很少。使用产生人 PS 的 HepG2 细胞，我们对由于添加雌二醇 (E2) 而导致的培养上清液中 PS 分泌的变化进行 ELISA 分析，发现表达减少了 30%。此外，使用实时 PCR 定量细胞内 PS mRNA 的变化，我们同样观察到由于 E2 的添加导致 mRNA 表达下降。我们目前正在克隆 PS 基因启动子区域，并使用荧光素酶报告基因分析分析 HepG2 细胞中 E2 对 PS 基因表达的调控动态。