イネいもち病菌におけるDNA二本鎖切断修復による進化機構の解明

阐明稻瘟菌DNA双链断裂修复的进化机制

• 批准号: 12J11224
• 负责人: 荒添 貴之
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Meiji University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012 至 2013
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J11224/
• 关键词: イネいもち病菌; DNA二本鎖切断; 相同組換え; 遺伝的多様性; 病原性変異; 人工ヌクレアーゼ; 遺伝子ターゲッティング; ゲノム編集; 体細胞相同組換え

本研究では無性的な生活環を有するイネいもち病菌の遺伝的多様性および病原性変異が, 体細胞分裂期に生じるDNA二本鎖切断(DSBs)を起点とした修復過程(相同組換え)において生じるかどうかの検証を目的とした。これまで, いもち病菌ゲノムにおけるDSBs修復機構について有用な知見は得られていない。そこで, 相同組換えモニター系および希少制限酵素遺伝子I-Sce Iを用いて, いもち病菌ゲノムにおける人為的DSBsの導入とその修復機構の基礎研究をおこなった。相同遺伝子がゲノム内に散在しているいもち病菌系統においては, 活性酸素誘導剤等の薬剤ストレスおよびDSBsの導入により, 非交叉型の相同組換えが有意に誘導されることを見出した。同様に, 相同組換えに必要な相同領域の長さや遺伝子のコピー数等の諸条件についても明らかにした。一方で, 相同配列が存在しない系統においては, 主に遺伝子内部またはその遺伝子領域全般が高い割合で欠失するのに対して, 相同配列を有する系統においては欠失の割合の減少に伴い, 相同組換え頻度の割合が上昇することから, 体細胞相同組換えはゲノムの安定化に寄与していると同時に, 多様性の創出にも貢献していることが考えられた。DSB修復と病原性変異との関連性を調査するために, 糸状菌用に改変した人工ヌクレアーゼZFNおよびTALENを構築した。ZFNはI-SceIの15%程度のヌクレアーゼ活性を示し, Scytalone dehydratase (SDH)遺伝子のターゲッティング効率を約50%程度まで上昇させたが, 強い細胞毒性が観察された。一方, TALENはI-SceIとほぼ同等のヌクレアーゼ活性を示し, SDH遺伝子ターゲッティング効率を100%まで上昇させた。以上より糸状菌用人工ヌクレアーゼの構築に成功し, 高効率遺伝子ターゲッティング法を確立した。さらに, 非病原性遺伝子を標的としたTALENによるDSB導入により, その修復過程でいもち病菌の病原性変異が生じることを見出した。

这项研究旨在验证在修复过程（同源重组）中，从DNA双链断裂（DSB）开始，在体细胞分裂阶段发生的DNA双链断裂（DSB）开始，水稻爆炸细菌的遗传多样性和致病性突变是否发生。迄今为止，尚未获得有关BLAST BLAST基因组中DSBS修复机制的有用发现。因此，我们对爆炸基因组中的人造DSB进行了基础研究，并使用同源重组监测器系统和罕见的限制酶基因I-SCE I. I-Sce I. I-Sce I.进行了修复机制。在基因组中散布同源基因的爆炸细菌菌株中，人们发现非跨性同源物质的压力是由药物引起的，诸如Oxy的造成了诸如Oxy和Oxeg的造成。同样，已经阐明了各种条件，例如同源区域的长度以及同源重组所需的基因复制数量。另一方面，在没有同源序列的线上，通常以高速率删除了基因和基因区域，而在与同源序列的线上，同源重组的比例随着缺失速率的降低而增加，这表明了体细胞的同源性同源性促进基因组的稳定性，并创建了促成多样性的促进，从而创造了产生的促进。为了研究DSB修复与致病突变之间的关联，对Zfn和Talen进行了人工核酸酶，修改了用于丝状真菌。 ZFN表现出约15％的I-SCEI的核酸酶活性，从而提高了Scytalone脱氢酶（SDH）基因的靶向效率，但观察到了强大的细胞毒性。另一方面，Talen表现出与I-SCEI几乎相同的核酸酶活性，将靶向效率的SDH基因提高到100％。基于上述，我们成功地为丝状真菌构建了人造核酸酶，并建立了一种高效的基因靶向方法。此外，已经发现，塔伦（Talen）在修复过程中发生了爆炸细菌的致病性突变，塔伦（Talen）靶向非致病基因。

项目成果

DNA double-strand breaks generated by yeast endonuclease I-See I induce ectopic homologous recombination and targeted gene replacement in Magnaporthe oryzae

酵母核酸内切酶 I-See I 产生的 DNA 双链断裂诱导稻瘟病菌中的异位同源重组和靶向基因替换

• 发表时间: 2013
• 作者: T. Arazoe;T. Younomaru;S. Ohsato;T. Arie;S.Kuwata
• 通讯作者: S.Kuwata

Highly efficient gene targeting in filamentous fungus Pyricularia oryzae by Platinum Gate TALEN system

Platinum Gate TALEN 系统对丝状真菌稻瘟病菌进行高效基因打靶

• 发表时间: 2014
• 作者: Takayuki Arazoe;Tetsuya Younomaru;Shuichi Ohsato;Tetsushi Sakuma;Takashi Yamamoto;Tsutomu Arie;Shigeru Kuwata
• 通讯作者: Shigeru Kuwata

Construction of a system for exploring mitotic homologous recombination in the genome of Pyricularia oryzae

• DOI: 10.1007/s10327-013-0474-2
• 发表时间: 2013-11-01
• 期刊: JOURNAL OF GENERAL PLANT PATHOLOGY
• 影响因子: 1.2
• 作者: Arazoe, Takayuki;Ohsato, Shuichi;Kuwata, Shigeru
• 通讯作者: Kuwata, Shigeru

TALENを用いた植物病原糸状菌Pyricularia oryzaeにおけるゲノム編集および進化機構解明への試み

尝试使用 TALEN 阐明植物病原真菌米瘟菌的基因组编辑和进化机制

• 发表时间: 2013
• 作者: 荒添貴之;用之丸哲也;大里修一;佐久間哲史;山本卓;有江力;桑田茂
• 通讯作者: 桑田茂

Experimental evidence of a pathogenic change caused by homologo us recombination between endogenous and introduced-dysfunctional Avr-Pita genes in Pyricularia oryzae

米瘟病菌内源性和引入功能失调的 Avr-Pita 基因同源重组引起致病性变化的实验证据

• DOI: 10.1007/s10327-013-0502-2
• 发表时间: 2014
• 期刊: Journal of General Plant Pathology
• 影响因子: 1.2
• 作者: Arazoe;T.;Kuwata;S.;Arie;T.;Ohsato;S.
• 通讯作者: S.