イネいもち病菌におけるDNA二本鎖切断修復による進化機構の解明

阐明稻瘟菌DNA双链断裂修复的进化机制

• 批准号: 12J11224
• 负责人: 荒添 貴之
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Meiji University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012 至 2013
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J11224/
• 关键词: イネいもち病菌; DNA二本鎖切断; 相同組換え; 遺伝的多様性; 病原性変異; 人工ヌクレアーゼ; 遺伝子ターゲッティング; ゲノム編集; 体細胞相同組換え

本研究では無性的な生活環を有するイネいもち病菌の遺伝的多様性および病原性変異が, 体細胞分裂期に生じるDNA二本鎖切断(DSBs)を起点とした修復過程(相同組換え)において生じるかどうかの検証を目的とした。これまで, いもち病菌ゲノムにおけるDSBs修復機構について有用な知見は得られていない。そこで, 相同組換えモニター系および希少制限酵素遺伝子I-Sce Iを用いて, いもち病菌ゲノムにおける人為的DSBsの導入とその修復機構の基礎研究をおこなった。相同遺伝子がゲノム内に散在しているいもち病菌系統においては, 活性酸素誘導剤等の薬剤ストレスおよびDSBsの導入により, 非交叉型の相同組換えが有意に誘導されることを見出した。同様に, 相同組換えに必要な相同領域の長さや遺伝子のコピー数等の諸条件についても明らかにした。一方で, 相同配列が存在しない系統においては, 主に遺伝子内部またはその遺伝子領域全般が高い割合で欠失するのに対して, 相同配列を有する系統においては欠失の割合の減少に伴い, 相同組換え頻度の割合が上昇することから, 体細胞相同組換えはゲノムの安定化に寄与していると同時に, 多様性の創出にも貢献していることが考えられた。DSB修復と病原性変異との関連性を調査するために, 糸状菌用に改変した人工ヌクレアーゼZFNおよびTALENを構築した。ZFNはI-SceIの15%程度のヌクレアーゼ活性を示し, Scytalone dehydratase (SDH)遺伝子のターゲッティング効率を約50%程度まで上昇させたが, 強い細胞毒性が観察された。一方, TALENはI-SceIとほぼ同等のヌクレアーゼ活性を示し, SDH遺伝子ターゲッティング効率を100%まで上昇させた。以上より糸状菌用人工ヌクレアーゼの構築に成功し, 高効率遺伝子ターゲッティング法を確立した。さらに, 非病原性遺伝子を標的としたTALENによるDSB導入により, その修復過程でいもち病菌の病原性変異が生じることを見出した。

在这项研究中，我们通过源自体细胞分裂过程中发生的 DNA 双链断裂 (DSB) 的修复过程（同源重组）研究了具有无性生命周期的稻瘟病菌的遗传多样性和致病变异。目的是验证这种情况是否发生在。迄今为止，尚未获得有关稻瘟病原基因组中 DSB 修复机制的有用信息。因此，我们利用同源重组监测系统和稀有限制性内切酶基因I-Sce I，对人工DSB引入稻瘟菌基因组及其修复机制进行了基础研究。我们发现，在稻瘟病菌菌株中，通过活性氧诱导剂等化学胁迫和 DSB 的引入，同源基因分散在基因组中，非交叉同源重组被显着诱导。同样，同源重组所需的各种条件，例如同源区域的长度和基因拷贝的数量也被阐明。另一方面，在不具有同源序列的菌株中，缺失发生率很高，主要是在基因内或其整个基因区域，而在具有同源序列的菌株中，缺失率降低，导致重组频率的增加表明体细胞同源重组不仅有助于基因组稳定，而且有助于创造多样性。为了研究 DSB 修复与致病突变之间的关系，我们构建了丝状真菌的工程核酸酶 ZFN 和 TALEN。尽管ZFN的核酸酶活性约为I-SceI的15%，并将Scytalone脱水酶（SDH）基因的靶向效率提高至约50%，但观察到较强的细胞毒性。另一方面，TALEN表现出与I-SceI几乎相同的核酸酶活性，并将SDH基因靶向效率提高至100%。基于此，我们成功构建了丝状真菌人工核酸酶，并建立了高效的基因打靶方法。此外，我们发现使用针对非致病基因的 TALEN 引入 DSB 会导致稻瘟病菌在修复过程中发生致病性突变。

项目成果

DNA double-strand breaks generated by yeast endonuclease I-See I induce ectopic homologous recombination and targeted gene replacement in Magnaporthe oryzae

酵母核酸内切酶 I-See I 产生的 DNA 双链断裂诱导稻瘟病菌中的异位同源重组和靶向基因替换

• 发表时间: 2013
• 作者: T. Arazoe;T. Younomaru;S. Ohsato;T. Arie;S.Kuwata
• 通讯作者: S.Kuwata

Highly efficient gene targeting in filamentous fungus Pyricularia oryzae by Platinum Gate TALEN system

Platinum Gate TALEN 系统对丝状真菌稻瘟病菌进行高效基因打靶

• 发表时间: 2014
• 作者: Takayuki Arazoe;Tetsuya Younomaru;Shuichi Ohsato;Tetsushi Sakuma;Takashi Yamamoto;Tsutomu Arie;Shigeru Kuwata
• 通讯作者: Shigeru Kuwata

Construction of a system for exploring mitotic homologous recombination in the genome of Pyricularia oryzae

• DOI: 10.1007/s10327-013-0474-2
• 发表时间: 2013-11-01
• 期刊: JOURNAL OF GENERAL PLANT PATHOLOGY
• 影响因子: 1.2
• 作者: Arazoe, Takayuki;Ohsato, Shuichi;Kuwata, Shigeru
• 通讯作者: Kuwata, Shigeru

TALENを用いた植物病原糸状菌Pyricularia oryzaeにおけるゲノム編集および進化機構解明への試み

尝试使用 TALEN 阐明植物病原真菌米瘟菌的基因组编辑和进化机制

• 发表时间: 2013
• 作者: 荒添貴之;用之丸哲也;大里修一;佐久間哲史;山本卓;有江力;桑田茂
• 通讯作者: 桑田茂

Experimental evidence of a pathogenic change caused by homologo us recombination between endogenous and introduced-dysfunctional Avr-Pita genes in Pyricularia oryzae

米瘟病菌内源性和引入功能失调的 Avr-Pita 基因同源重组引起致病性变化的实验证据

• DOI: 10.1007/s10327-013-0502-2
• 发表时间: 2014
• 期刊: Journal of General Plant Pathology
• 影响因子: 1.2
• 作者: Arazoe;T.;Kuwata;S.;Arie;T.;Ohsato;S.
• 通讯作者: S.