電子線結晶学によるV-ATPaseの構造解析

通过电子束晶体学分析 V-ATP 酶的结构

基本信息

批准号：
06F06185
负责人：
藤吉好則
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

イオンポンプであるV-ATPaseの結晶化を行い、その立体構造を解析する研究を進めているが、これは非常にチャレンジングな研究課題である。しかし、結晶化条件を論理的に考えて最適化することによってV-ATPaseの結晶化に成功し、投影構造の解析に成功した。V-type ATPase(V-ATPase)は、F-ATPase,A-ATPaseなどと多くのATPaseファミリーを構成する重要なエネルギー変換機能を有する膜タンパク質で、電気化学的勾配を化学エネルギーに変換するタイプのATPaseである。P-type ATPaseの高分解能構造解析やF-ATPaseのF1部分の高分解能の構造解析は行われているが、V-ATPaseの高分解能の構造は解析されていない。上記エネルギー変換の分子機構の詳細を理解するためには、V-ATPaseの高分解能の構造解析が望まれる。しかも、理想的にはこの膜タンパク質が膜に入った状態での構造が必要である。この様な高分解能の構造解析を目指して、高度好熱菌(Thermus thermophilus)からV-ATPaseを精製する系を立ち上げ、Triton X-100などの界面活性剤を検討して安定に精製できるシステムを構築した。この分子は、V1とV0ドメインが乖離する傾向にあるので、精製後できる限り素早く結晶化を試みることなどによって、色々な輻合構造の2次元結晶を作製する条件を発見した。我々の研究室には、独自に開発した極低温高分解能電子顕微鏡が設置されているので、この極低温電子顕微鏡を用いた解析のための試料作製法を検討した。現状では高分解能の立体構造解析は不可能であるが、極低温電子顕微鏡像の解析から、投影構造を解析することに成功した。その結果、現在まで議論が続いているV0ドメインのサブユニットの数について12本のヘリックスから構成されるという新しい知見を得ることに成功した。これはこれまでに知られていない新しい興味深い結果である。また、結晶性の悪い2次元結晶について、電子線トモグラフィー法を用いてその解析を行った結果、結晶性が悪くなる原因を知ることが出来た。このように、V-ATPaseの精製と2次元結晶化、それと電子線結晶学を用いた膜タンパク質の構造と機能研究について重要な研究成果を上げた。

我们正在进行离子泵V-ATP酶结晶并分析其三维结构的研究，但这是一个极具挑战性的研究课题。然而，通过逻辑考虑和优化结晶条件，我们成功地结晶了V-ATP酶并成功分析了其预计结构。 V型ATP酶（V-ATPase）是一种具有重要能量转换功能的膜蛋白，构成了F-ATP酶、A-ATP酶等众多ATP酶家族，是一类将电化学梯度转化为化学能的膜蛋白。是一种ATP酶。虽然已经进行了P型ATP酶的高分辨率结构分析和F-ATP酶的F1部分的高分辨率结构分析，但尚未分析V-ATP酶的高分辨率结构。为了了解上述能量转换的分子机制的细节，需要对V-ATP酶进行高分辨率结构分析。此外，理想地，需要一种膜中含有该膜蛋白的结构。为了实现这种高分辨率的结构分析，我们建立了从嗜热栖热菌中纯化V-ATP酶的系统，并研究了Triton X-100等表面活性剂，以开发出可以稳定纯化它的系统。由于该分子的 V1 和 V0 结构域往往会发散，因此通过尝试在纯化后尽快使其结晶，我们发现了生产具有各种会聚结构的二维晶体的条件。我们实验室配备了我们自主研发的低温高分辨率电子显微镜，因此我们研究了使用该低温电子显微镜进行分析的样品制备方法。尽管目前无法进行高分辨率三维结构分析，但我们成功地分析了低温电子显微镜图像的投影结构。结果，他们成功获得了迄今为止一直争论不休的V0结构域亚基数量由12个螺旋组成的新知识。这是一个以前未知的新的、有趣的结果。此外，通过使用电子断层扫描技术分析结晶度差的二维晶体，我们能够了解结晶度差的原因。这样，我们在V-ATP酶的纯化和二维结晶、电子束晶体学膜蛋白的结构和功能研究方面取得了重要的研究成果。