細胞運動のレドックス調節機構の研究

细胞运动氧化还原调控机制研究

基本信息

批准号：
18870003
负责人：
若林憲一
金额：
$ 1.79万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

[本年度の成果]i)変異を導入したダイニン型チオレドキシンLC3/LC5による基質トラップ前年度までに作成した、活性部位のCysをSerに変異させたLC3とLC5のcDNAを、クラミドモナス野生株に導入した。変異チオレドキシンはジスルフィド結合を介して基質をトラップすることができる。この際、前年度に基質の収率が悪かったHA-tagではなく6xHis-tagを融合させた。しかし、明らかに非特異的と思われるタンパク質をトラップしたため、この方法をとりやめ、HA-tagで発現量の多い形質転換体を再スクリーニングした。現在、それらの株を用いてLC3/LC5-基質の複合体の精製を試みている。ii)チオレドキシン還元酵素(TR)の鞭毛での存在の確認チオレドキシンだけでなく、その他のレドックス関連タンパク質の鞭毛内での振る舞いを知るべく、TRに着目した。鞭毛内にはダイニン型チオレドキシンが存在するのに、その活性維持に欠かせないTRが鞭毛プロテオームに記載されていなかった。私はクラミドモナスのESTデータベースを検索し、いくつかのTRのうち細胞質性TRであるTR1に着目し、抗体を作成した。するとたしかに鞭毛の細胞質に局在していることがわかった。[重要性など]i)はチオレドキシン配列とHis-tagの相性の悪さなど予想外の困難があったが、近日中に基質を同定できる予定である。同定できた暁には、モータータンパク質の機能の理解に新しい切り口を提供するはずである。ii)は、鞭毛内に機能的なチオレドキシンが存在することの証左となる。もしも細胞質型チオレドキシンと相互作用するTR1がLC3,LC5とも相互作用するならば、異なるファミリーのチオレドキシンが同一のTRで活性を保つことになり、新たなレドックス・シグナリング経路が発見できたことになる。

[今年的结果] i) 使用突变动力蛋白型硫氧还蛋白 LC3/LC5 进行底物捕获将去年制作的活性位点 Cys 突变为 Ser 的 LC3 和 LC5 的 cDNA 导入野生株衣藻。突变的硫氧还蛋白可以通过二硫键捕获底物。此时，融合了 6xHis-tag，而不是前一年底物产量较差的 HA-tag。然而，由于我们捕获了明显非特异性的蛋白质，因此我们停止了这种方法并使用 HA 标签重新筛选具有高表达水平的转化体。我们目前正在尝试使用这些菌株纯化 LC3/LC5 底物复合物。 ii）确认鞭毛中硫氧还蛋白还原酶（TR）的存在为了了解硫氧还蛋白以及鞭毛中其他氧化还原相关蛋白的行为，我们将重点放在TR上。尽管鞭毛内存在动力蛋白型硫氧还蛋白，但对于维持其活性至关重要的TR尚未在鞭毛蛋白质组中得到描述。我搜索了衣藻 EST 数据库，重点关注 TR1（一种细胞质 TR），并创建了一种抗体。他们发现它确实位于鞭毛的细胞质中。 [重要性等] 关于i)，存在意想不到的困难，例如硫氧还蛋白序列和His-标签之间的兼容性差，但我们计划在不久的将来能够识别底物。一旦确定，它将为理解运动蛋白的功能提供新的视角。 ii) 提供鞭毛内存在功能性硫氧还蛋白的证据。如果与细胞质硫氧还蛋白相互作用的TR1也与LC3和LC5相互作用，来自不同家族的硫氧还蛋白将在同一TR中保持活性，并且将发现新的氧化还原信号通路。