新たに発見した牛乳頭腫ウイルス12型(BPV-12)の転写と複製機序の解析

新发现的牛棉铃病毒12型（BPV-12）的转录和复制机制分析

• 批准号: 12J01466
• 负责人: 朱 偉
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: University of Miyazaki
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012 至 2014
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J01466/
• 关键词: 牛乳頭腫ウイルス; BPV-12; ゲノム欠損BPV-12-del; トランスフェクション

BPV12とBPV12-delの全ゲノム解析を行ってその違いを比較するために、BPV-12とBPV12-delの全ゲノムをpUC19とpcDNA3.1ベクターに組み込んだ全ゲノム分子クローンを構成した。一方、大腸菌によるタンパク発現をみるためBPV12とBPV12-delの各初期遺伝子(E1、E2、E4、E7、E8)を増幅させ、それぞれpUC19ベクター内に結合させた。真核細胞における発現をみるためにE1とE2遺伝子はpcDNA3.1ベクターにも組み込んだ。DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)-10%FBS(ウシ胎仔血清)培地にて培養したHela細胞にpBPV-12のpE1、pE2ならびにpBPV-12-delのpE1、pE2の組換え体プラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞からDNAとRNAを抽出し、複製と転写を確認するために、Real timePCRと逆転写-Real time PCRを行った。その結果、DNA複製がみられることは確認できたが、mRNAを検出することはできなかった。BPV12の転写も確認できなかった。牛乳頭腫ウイルス(BPV)の潜伏期間は1か月から1年間と予想されることから、トランスフェクションした細胞を10代継代培養したが、BPV12の転写は確認できなかった。Hela細胞に代えて、vero細胞、L細胞、MA104細胞、HRT-18細胞にこれら組み換え体をトランスフェクションしたが、BPV12の複製を確認できたのみでmRNAを検出することはできなかった。マウスの肺および腎臓の初代細胞へのトランスフェクションの結果も同様であった。以上、新しく発見されたウイルスBPV12が牛の舌に形成された乳頭腫から検出された。同部位から細胞を採取し継代培養を試みたが、不死化は起こらず、連続継代培養ができなかった。乳頭腫ウイルスは感染動物からの分離が困難であることはよく知られているが、全ゲノムで構成された分子クローンをトランスフェクションした細胞の増殖もまた困難であると考えられる。

为了对BPV12和BPV12-DEL进行全基因组分析并比较差异，我们构建了全基因组分子克隆，其中BPV-12和BPV12-DEL的全基因组基因组被整合到PUC19和PCDNA3.1载体中。另一方面，为了显示大肠杆菌的蛋白质表达，将BPV12和BPV12-DEL的早期基因（E1，E2，E4，E7，E8）放大并连接到PUC19载体中。 E1和E2基因也被整合到PCDNA3.1载体中，以观察真核细胞中的表达。在DMEM（Dulbecco修饰的Eagle的培养基）中培养的HELA细胞-10％FBS（胎牛血清）培养基被PBPV-12 PE1和PE2重组质粒的PBPV-12-DEL PE1和PE2转染。从转染的细胞中提取DNA和RNA，并进行实时PCR和逆转录时间PCR以确认复制和转录。结果，已经确认观察到DNA复制，但无法检测到mRNA。 BPV12的转录也无法确认。由于预计乳头状瘤病毒（BPV）的孵育周期为1个月至1年，因此在青少年中将转染的细胞取代，但是无法确认BPV12的转录。这些重组者不是HeLa细胞，而是转染到Vero细胞，L细胞，MA104细胞和HRT-18细胞中，但仅确认BPV12的复制，但无法检测到mRNA。将小鼠肺和肾脏转染到原代细胞中的结果相似。在牛的舌头形成的乳头状瘤中检测到了新发现的病毒BPV12。从同一地点收集细胞，并试图进行亚文化，但不会发生永生化，并且无法进行连续的亚文化。众所周知，乳头状瘤病毒很难从感染的动物中分离出来，但也认为，用全基因组分子克隆转染的细胞的增殖也很困难。

项目成果

The likelihood of insect transmission of BPV in an outbreak of teat papillomatosis in Holstein dairy cattle

荷斯坦奶牛乳头乳头状瘤病爆发中 BPV 昆虫传播的可能性

• 发表时间: 2014
• 作者: Eri Yamasaki;Atsushi Kawakita;Shoko Sakai;董建宝
• 通讯作者: 董建宝

Development of nested PCR and real-time PCR assays to detect equine infectious anemia virus infection

开发巢式 PCR 和实时 PCR 检测方法来检测马传染性贫血病毒感染

• 发表时间: 2013
• 作者: Eri Yamasaki;Atsushi Kawakita;Shoko Sakai;董建宝;朱 偉;董 建宝
• 通讯作者: 董 建宝

Bovine papillomavirus type 10 with a natural deleted genome associated with tongue mucosal papilloma in cattle

具有与牛舌粘膜乳头状瘤相关的天然缺失基因组的牛乳头瘤病毒 10 型

• 发表时间: 2013
• 作者: Eri Yamasaki;Atsushi Kawakita;Shoko Sakai;董建宝;朱 偉
• 通讯作者: 朱 偉