革新的蛍光ラベル化法に基づくタンパク質の高感度イメージングとその創薬研究への応用

基于创新荧光标记方法的蛋白质高灵敏度成像及其在药物发现研究中的应用

基本信息

批准号：
12J01172
负责人：
平林和久
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J01172/
关键词：
蛍光プローブ pHプローブ Ca^<2+>プローブ

项目摘要

昨年度は2-COOH TMの詳細な化学平衡式を推定することに成功した。またハロゲン原子の導入により、赤色蛍光プローブの母核として優れた性質を有すると考えられる2-COOH TM誘導体の開発に成功した。赤色蛍光プローブの充実は、他の生理活性物質に対する緑色蛍光プローブと併用したマルチカラーイメージングによって、複数の分子の挙動を同時に解析することが可能となるため、その開発には大きな意義がある本年度はさらに別の修飾部位への置換基の導入と化学平衡式との相関を調べた。その結果、pH変動に対する吸光度変化の鋭さが、置換基のハメット定数に応じて変化することを見出した。本知見によって、本色素を用いた赤色蛍光プローブを開発する際に、「生理的pH付近でのpHに依存した蛍光変化を小さくすること」、逆に、「小さなpH変化を大きな蛍光変化として捉えること」が可能となる。次に、得られた知見に基づいて、2-COOH TM誘導体を母核とした新規赤色蛍光Ca^<2+>プローブの開発を行った。Ca^<2+>は細胞内で重要なセカンドメッセンジャーとして様々な生命現象に関与している。そのため、緑色蛍光Ca^<2+>プローブを用いたCa^<2+>イメージングが汎用されている。しかしながら、有用な赤色蛍光Ca^<2+>プローブは依然として開発されていない。実際に2-COOH TM誘導体を母核として開発した赤色蛍光Ca^<2+>プローブはCa^<2+>添加時に約8倍の蛍光上昇を示した。さらに、本プローブをHela細胞に応用したところ、その細胞内局在は細胞質と核であり、現在汎用されている緑色蛍光Ca^<2+>プローブと同様であった。また、ヒスタミン刺激時のCa^<2+>濃度変動を蛍光強度変化として捉えることに成功した。開発した蛍光プローブは今後赤色蛍光Ca^<2+>プローブとしてマルチカラーイメージングに利用されることが期待される。

去年，我们成功估算了2-COOH TM 的详细化学平衡方程。此外，通过引入卤素原子，我们成功开发了2-COOH TM 衍生物，该衍生物被认为具有作为红色荧光探针母核的优异性能。红色荧光探针的扩展将使得通过多色成像与其他生理活性物质的绿色荧光探针相结合来同时分析多个分子的行为成为可能，因此今年它们的发展具有重要意义。此外，我们还研究了它们之间的相关性。向其他修饰位点引入取代基和化学平衡方程。结果，我们发现吸光度变化相对于pH变化的锐度根据取代基的哈米特常数而变化。基于这些知识，当使用这种染料开发红色荧光探针时，我们专注于“减少接近生理 pH 值的 pH 依赖性荧光变化”，相反，“将小的 pH 变化识别为大的荧光变化。” ”成为可能。接下来，基于所获得的知识，我们开发了一种以2-COOH TM 衍生物为核心的新型红色荧光Ca^2+探针。 Ca 2+ 作为细胞内重要的第二信使参与多种生物现象。因此，使用绿色荧光Ca^2+探针的Ca^2+成像被广泛使用。然而，尚未开发出有用的红色荧光Ca 2+ 探针。事实上，使用2-COOH TM 衍生物作为核心开发的红色荧光Ca 2+ 探针在添加Ca 2+ 后显示荧光增加约8倍。此外，当该探针应用于Hela细胞时，其细胞内定位在细胞质和细胞核中，类似于目前广泛使用的绿色荧光Ca 2+ 探针。另外，我们成功地将组胺刺激期间Ca 2+ 浓度的变化捕获为荧光强度的变化。所开发的荧光探针有望在未来作为红色荧光Ca^2+探针用于多色成像。