機能性ノンコーディングRNAを用いた葉緑体形質転換による核遺伝子制御技術の開発

利用功能性非编码RNA开发叶绿体转化核基因控制技术

基本信息

批准号：
12J00710
负责人：
田中義行
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Kyoto Sangyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J00710/
关键词：
緑体形質転換ウイロイドナス科 Solanum

项目摘要

葉緑体形質転換は花粉による遺伝子拡散がないという点で従来の遺伝子組み換えより優れた技術であるが、葉緑体は2重膜に包まれており、葉緑体内で発現したRNAやタンパク質は核遺伝子に影響を及ぼすことができないという問題点がある。本研究では、葉緑体形質転換による核遺伝子の発現制御技術の開発を目的として、葉緑体膜を通過するRNA分子・ウイロイドの利用を検討した。葉緑体形質転換用ベクターpPRV112A'にEggplant latent viroid(ELVd)のcDNA配列を導入し、形質転換用コンストラクトを作成した。コンストラクトをタバコ(Nicotiana tabacum)の葉にパーティクルガンを用いて導入し、ELVd導入タバコを得た。ELVd由来のsmall RNAを検出することによって、葉緑体内から細胞質へELVd分子が移行しているかを検証した。結果、ELVdの分解によるsmall RNAは検出されず、葉緑体から細胞質へのRNAの移行は認められなかった。併せて、ELVdの宿主範囲の調査を行い、ELVdの移行能や増殖能や機能性が発揮される植物種を明らかにした。これまでELVdの感染はナス(S.melongena)でしか報告されていない。ナスおよびその近縁種にin vitro転写で作成したELVd分子を接種した。接種処理から1カ月後の植物体の葉からRNAを抽出し、ノーザンプロットによりELVdの感染の有無を調査した。結果、S.melongena以外にも、S.aethibpicum,S.macrocarpon,S.torvum,S.mammosum,でELVdの感染が認められた。これらのことから、Solanum属のSubgenus Leptostemonumの植物はELVdの宿主になると考えられた。

叶绿体转化是一种比常规遗传修饰更好的技术，因为没有花粉引起的遗传扩散，但是叶绿体包裹在双膜中，而RNA和蛋白质在叶绿体中表达。在这项研究中，考虑使用叶绿素转化来开发核基因表达控制技术的RNA分子和怪异物的使用。在叶绿体转化载体pprv112a'的载体中引入了茄子潜伏病毒（ELVD）的cDNA序列，并创建了用于转化的转化构建体。该结构是在香烟（Nicotiana tabacum）的叶子上引入的，使用派对枪获取ELVD介绍香烟。检测到ELVD衍生的小RNA，以验证ELVD分子从叶绿体转移到细胞质。结果，由于ELVD的拆卸，未检测到没有小的RNA，并且不允许RNA从叶绿体向细胞质的迁移。同时，我们对宿主之王进行了ELVD所有者调查，揭示了一种植物物种，该物种证明了ELVD的迁移能力，生长和功能。到目前为止，仅在茄子（S.Melongena）中报道了ELVD感染。通过体外转移产生的ELVD分子在茄子和附近的物种中接种。接种疫苗处理后一个月，从植物的叶片中提取RNA，北部的阴谋调查了ELVD感染的存在。结果，除S.Melongena外，S.Aethibpicum，S.Macrocarpon，S.Torvum，S.Mammosum等都观察到ELVD感染。这些事实表明，卵巢属亚属植物植物将是埃尔维德领主。