個体における概日時計制御機構の解析

个体生物钟控制机制分析

• 批准号: 12J00639
• 负责人: 田宮 寛之
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J00639/
• 关键词: 概日時計; 12灯用LED照度制御装置; ES分化誘導系; Per1とPer2の協調機構; 睡眠相前進症候群(FASPS); Per2ノックアウトレスキュー系; 短周期親和性PER1,長周期親和性PER2蛋白; 病的破綻; プロモーター; ES細胞; 分化誘導; 同調性

Per1とPer2は概日振動に必須の遺伝子であるが,両遺伝子の協調性に関しては未解明な部分が多い.本研究では新しい実験手法の開発とそれに基づく解析を行った.Per1,Per2各々のヘテロ,ホモノックアウトマウスを恒常明条件下で飼育した所,周期長はPer1とPer2の量比に依存しており,周期性消失はPer1,Per2の片方がないと起こりにくい事が示された.次に,位相応答が起きないような緩徐な光変化に対する個々のマウスの応答性を確認する為,12灯用LED照度制御装置を開発し,1分毎に任意のパターンの光をマウスに照射した際の概日リズム応答を検出可能な系を構築した.この装置を用いて22時間から27時間周期の緩徐に変化する光を照射した所,WTと比較してPer1(-/-)は長周期側に,Per2(-/-)は短周期側に,同調可能な周期の幅が広い事が示された.次にPer1とPer2の協調性を細胞レベルで検出する為,細胞レベルのPer2ノックアウトレスキュー系の構築を目指した.まず,ES細胞は概日リズムを持っていないが分化誘導をすると概日振動が発現することに着目し,ES細胞から10周期分の概日振動を検出し,小さな誤差で周期を測定可能な実験プロトコールを確立した.また,Per2 ノックアウトES細胞のRosa26にPer2遺伝子1コピーを正確に導入し,分化誘導することで,約24時間の振動を検出した.更に,Per2が原因遺伝子である睡眠相前進症候群(FASPS)の変異体を導入すると,個体同様に周期短縮が見られ,FASPS変異体の周期短縮を世界で初めて細胞レベルで再現する事に成功した.また,mut6変異体を導入するとFASPS同様の周期短縮がみられた.更にPer2 promoter下にPer1の翻訳領域を導入したところ,周期短縮が見られ,蛋白レベルの違いが周期親和性の違いを規定する事が示された.総じて,短周期親和性のPER1蛋白と長周期親和性のPER2蛋白は協調し,非生理的な環境条件下において概日周期長を24時間に限定する役割を持っている反面,低柔軟性のため病的破綻しうることを示した.

PER1和PER2是昼夜节律振荡的必不可少的基因，但是两个基因之间的配位有许多未知方面。在这项研究中，我们开发了一种新的实验方法，并根据它进行了分析。当将PER1和PER2的异性和同型液小鼠保持在恒定条件下时，循环长度取决于PER1和PER2的量之比，并且表明没有PER1和PER2之一，循环损失将很难发生。接下来，为了确认单个小鼠对不会引起相位响应的光变化的反应能力，我们开发了一个12灯的LED照明控制装置，并且每分钟用任意光模式照射小鼠时，进行了昼夜节律响应。我们构建了一个检测答案的系统。使用该设备，我们辐照的光线从一个周期缓慢变为27小时，与WT相比，PER1（ - / - ）的光线显示为较宽的可调周期，PER2（ - /-）在长期侧面，PER2（ - / - ）在短周期的一侧。接下来，为了检测细胞水平的PER1和PER2之间的协调，我们旨在在细胞水平上构建PER2敲除救援系统。首先，我们集中于ES细胞没有昼夜节律的事实，但是当诱导分化时，我们检测到来自ES细胞的10个昼夜节律振动的循环，并建立了一种实验方案，使我们能够用较小的误差测量循环。此外，还建立了PER2。通过准确地将PER2基因的副本引入敲除ES细胞中的Rosa26并诱导分化，检测到振荡约24小时。此外，当睡眠期促进综合征的突变体（FASP）（FASPS）是PER2的原因时，以与个体相同的方式观察到循环降低，并且FASPS突变体的循环降低在世界上首次在细胞水平上成功复制。另外，当引入MUT6突变体时，以与FASP相同的方式观察到循环降低。此外，当PER2在启动子下引入PER1的平移区域时，观察到了周期缩短，并表明蛋白质水平的差异定义了周期亲和力的差异。总体而言，虽然短周期PER1蛋白和长周期性PER2蛋白会配合，并且在非生理环境条件下将昼夜节律长度限制在24小时的作用，但较低的柔韧性可能导致病理崩溃。