薬剤排出ポンプの構造・機能・発現制御と生理的役割に関する研究

药物外排泵的结构、功能、表达调控及生理作用研究

基本信息

批准号：
12J00486
负责人：
山崎聖司
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至 2014-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

大腸菌の薬剤排出ポンプAcrBを阻害するピリドピリミジン誘導体ABI-PPは、緑膿菌の薬剤排出ポンプMexBの特異的阻害剤であるが、多剤耐性緑膿菌のもう1つの有力な原因である薬剤排出ポンプMexYを全く阻害できず、多剤耐性緑膿菌感染症の治療薬にはならなかった。AcrB・MexBとABI-PPとの共結晶を解析した結果、薬剤排出ポンプの遠位ポケット内部に阻害剤結合ピットの存在が示唆された。そこでまずABI-PPの阻害剤としての機能を調べたところ、基質であるドキソルビシンとは異なり、ABI-PPはAcrBによって全く排出されないことが分かった。この結果から、ABI-PPは遠位ポケット内の阻害剤結合ピットに強く結合することで、薬剤排出ポンプの蠕動機構を抑制していることが示された。続いてABI-PPの結合部位を解析したところ、AcrB・MexBの阻害剤結合ピットにあるフェニルアラニン(F)が、MexYの同位置ではトリプトファン(W)に置き換わっており、その大きな側鎖による立体障害でABI-PPが結合できなくなっていると考えられた。各種変異株を解析した結果、AcrB_F178W変異体はABI-PPの阻害を受けなくなり、MexY_W177F変異体は逆に阻害されるようになった。一方、MexB_F178W変異体は、依然としてABI-PPの阻害を受けていた。この原因を探るため、MexB_F178WとABI-PPの共結晶を解析したところ、MexBの阻害剤結合ピットにはわずかに余裕があり、トリプトファンに変異してもピット内に側鎖が突き出さないことが示唆された。そこで、ピット内部のスペースをわずかに増やしたAcrB_F178W/V139A変異体、MexY_Il38A変異体を構築して解析した結果、トリプトファンがあるにも関わらず、ABI-PPの阻害を受けるようになることが明らかとなった。阻害剤ABI-PPに対する感受性は、阻害剤結合ピットにおけるごくわずかな立体障害によって決まることを明らかにした本論文は、Nature誌に採択・掲載された。この立体障害を回避するような誘導体を分子設計することで、AcrB, MexBのみならず、MexYを含めた広域薬剤排出ポンプ阻害剤の開発が可能になると考えられる。

ABI-PP是吡啶并嘧啶衍生物，可抑制大肠杆菌药物外排泵AcrB，是铜绿假单胞菌药物外排泵MexB的特异性抑制剂，而MexB是多重耐药铜绿假单胞菌的另一个潜在原因，无法抑制药物外排泵 MexY 根本无法用于治疗多重耐药铜绿假单胞菌感染。对 AcrB/MexB 和 ABI-PP 共晶体的分析表明，药物外排泵远端袋内存在抑制剂结合坑。我们首先研究了 ABI-PP 作为抑制剂的功能，发现与底物阿霉素不同，ABI-PP 根本不被 AcrB 分泌。这些结果表明，ABI-PP 通过与远端口袋中的抑制剂结合坑强烈结合来抑制药物流出泵的蠕动机制。随后对 ABI-PP 结合位点的分析表明，AcrB/MexB 抑制剂结合坑中的苯丙氨酸 (F) 在 MexY 中的相同位置被色氨酸 (W) 取代，这表明由于其大侧链 It 造成的空间位阻。认为ABI-PP无法结合。对各种突变株的分析表明，AcrB_F178W突变体不再被ABI-PP抑制，而MexY_W177F突变体则被抑制。另一方面，MexB_F178W突变体仍然受到ABI-PP的抑制。为了探究其原因，我们分析了MexB_F178W和ABI-PP的共晶，发现MexB的抑制剂结合凹坑有轻微的边缘，即使突变为色氨酸，侧链也不会突出到坑建议。因此，通过构建并分析凹坑内部空间稍微增大的AcrB_F178W/V139A突变体和MexY_Il38A突变体，可知尽管存在色氨酸，它们仍受到ABI-PP的抑制。该论文揭示了对抑制剂 ABI-PP 的敏感性是由抑制剂结合坑中的最小空间位阻决定的，该论文被《Nature》接受并发表。通过分子设计避免这种空间位阻的衍生物，人们认为将有可能开发出不仅包括 AcrB 和 MexB 还包括 MexY 的广谱药物外排泵抑制剂。

项目成果

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专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

原核細胞のトランスポートソーム解析

原核细胞的转运体分析

DOI：
发表时间：
2013
期刊：
影响因子：
0
作者：
山崎聖司;中島良介;櫻井啓介;林克彦;長田親弘;星野一樹;小野寺宜郷;西野邦彦;山口明人;山崎聖司
通讯作者：
山崎聖司

Peristaltic drug export mechanism of the multidrug exporter AcrB

多药输出蛋白 AcrB 的蠕动药物输出机制

DOI：
发表时间：
2013
期刊：
影响因子：
0
作者：
Seiji Yamasaki;Kunihiko Nishino;Ryosuke Nakashima;Keisuke Sakurai and Akihito Yamaguchi
通讯作者：
Keisuke Sakurai and Akihito Yamaguchi

Structures of the multidrug exporter AcrB reveal a proximal multisite drug-binding pocket

DOI：
10.1038/nature10641
发表时间：
2011-12-22
期刊：
NATURE
影响因子：
64.8
作者：
Nakashima, Ryosuke;Sakurai, Keisuke;Yamaguchi, Akihito
通讯作者：
Yamaguchi, Akihito

多剤排出トランスポーターの阻害剤結合様式と阻害メカニズムの解明

阐明多药外排转运蛋白的抑制剂结合模式和抑制机制

DOI：
发表时间：
2014
期刊：
影响因子：
0
作者：
山崎聖司;中島良介;櫻井啓介;林克彦;長田親弘;星野一樹;小野寺宜郷;西野邦彦;山口明人
通讯作者：
山口明人

Structures of AcrB Multidrug Efflux Pump Reveal the Peristaltic Drug Export Mechanism

AcrB多药外排泵的结构揭示了蠕动药物输出机制

DOI：
发表时间：
2013
期刊：
影响因子：
0
作者：
Seiji Yamasaki;Kunihiko Nishino;Ryosuke Nakashima;Keisuke Sakurai and Akihito Yamaguchi
通讯作者：
Keisuke Sakurai and Akihito Yamaguchi