葉緑体型ATP合成酵素の活性制御を分子レベルで理解する

了解分子水平上叶绿体型 ATP 合酶活性的调节

• 批准号: 11J09051
• 负责人: 砂村 栄一郎
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J09051/
• 关键词: ATP合成酵素; シアノバクテリア; 活性調節

昨年度に引き続き、葉緑体型ATP合成酵素の活性制御機構を解明するために、シアノバクテリアATP合成酵素を用いて、X線結晶構造解析を行った。昨年度に最適化した条件で結晶を作製し、放射光施設で回折実験を行ったが、分解能の向上は見られなかった。そこで、結晶から水分子を取り除くことで分解能を向上させる脱水操作を試みた。しかし、今のところ、分解能の向上は見られない。また、αサブユニットのN末端にある余分なアミノ配列を切断することで、分解能が向上するのではないかと考え、余分な配列を数残基ずつ切断した変異体を作製した。この変異体の精製及び結晶化を行った。しかし、切断前と同じ結晶化条件では結晶が作製できなかった。酵素の熱安定性が大きく変化したためと考えられる。現在、熱安定性を大きく変化させずに分解能の向上させる変異体を作製中である。また、この酵素を構成するγサブユニットにあるN末端およびC末端のαヘリックスのコイルドコイル構造が活性制御に重要な役割を果たしているのではないかと考え、αヘリックスに人為的に固定する実験を、昨年度に引き続き行った。具体的には、αヘリックスにCysを導入し、S-S華僑をするで、コイルドコイルの相対的位置を固定した。作製した変異体の中には、酵素活性が大きく上昇する変異体があった。また、阻害サブユニットであるεに対する挙動にも変化があった。S-S華僑をする前は、100%近い阻害率であったが、華僑をすることで、40%近くまで阻害率が減少する変異体が得られた。N末端およびC末端のαヘリックス間の相対的な位置関係が、活性の制御に重要な役割を果たすことを示唆する結果が得られた。さらに、この結果から、シアノバクテリアに加えて、高等植物のATP合成酵素の活性制御のメカニズムを推測することができた。

去年之后，使用蓝细菌ATP合酶进行X射线晶体结构分析，以阐明叶绿体型ATP合酶的活性控制机理。在去年优化的条件下制备晶体，并在同步加速器辐射设施上进行了衍射实验，但没有观察到分辨率的改善。因此，我们尝试通过去除晶体中的水分子来改善分辨率的脱水操作。但是，目前，解决方案尚无改善。此外，我们认为在α亚基的N末端裂解过量的氨基序列可能会改善分辨率，并产生一个突变体，其中一次过量序列一次在几个残基上切割。该突变体被纯化并结晶。但是，在与切割之前的结晶条件下不能产生晶体。这被认为是因为该酶的热稳定性发生了重大变化。目前，正在生产突变体，以改善分辨率，而不会显着改变热稳定性。此外，我们继续进行实验，以人为地固定构成该酶在控制活性中起重要作用的γ亚基中N端和C端的α-螺旋结构的盘绕线圈结构，并从去年开始。具体而言，将CYS引入α-螺旋中，并使用S-S中文来固定盘绕线圈的相对位置。在产生的突变体中，有一些突变体的酶活性显着增加。此外，抑制性亚基ε的行为发生了变化。在S-S中文之前，抑制率接近100％，但通过中国人，获得了一个突变体，该突变体将抑制率降低了近40％。获得了结果，表明N-和C末端α螺旋之间的相对位置关系在调节活性中起重要作用。此外，除此之外，还可以推断出除蓝细菌外，还可以确定高等植物中ATP合成酶活性的机制。

项目成果

シアノバクテリアF1ATPaseにおけるrサブユニットの構造変化と活性制御の関連

蓝藻F1ATP酶r亚基结构变化与活性调节的关系

• 发表时间: 2012
• 作者: Kenichiro Shiraya;Akihiko Takahashi;Masashi Toda;戸田真史;Toru Hisabori;Ei-ichiro Sunamura;Imashimizu Mari;砂村栄一郎;Ei-ichiro Sunamura;砂村栄一郎
• 通讯作者: 砂村栄一郎

Conformational change of the Y subunit regulates the ATP hydrolysis activity of cyanobacterial ATP synthase

Y亚基构象变化调节蓝藻ATP合酶的ATP水解活性

• 发表时间: 2012
• 作者: Kenichiro Shiraya;Akihiko Takahashi;Masashi Toda;戸田真史;Toru Hisabori;Ei-ichiro Sunamura;Imashimizu Mari;砂村栄一郎;Ei-ichiro Sunamura
• 通讯作者: Ei-ichiro Sunamura

Conformational change of the y subunit indirectly regulates the activity of cyanobacterial Fi-ATPase

y亚基构象变化间接调节蓝藻Fi-ATP酶活性

• DOI: 10.1074/jbc.m112.395053
• 发表时间: 2012
• 期刊: J. Biol. Chem.,
• 作者: Nagai K;Tanida M;Niijima A;Tsuruoka N;Kiso Y;Horii Y;Shen J;Okumura N.;Ei-ichiro Sunamura
• 通讯作者: Ei-ichiro Sunamura

葉緑体型ATP合成酵素の活性制御には、γサブユニットのαヘリックスのずれが関与する

叶绿体型 ATP 合酶活性的调节涉及 γ 亚基的 α 螺旋的错位。

• 发表时间: 2012
• 作者: Kenichiro Shiraya;Akihiko Takahashi;Masashi Toda;戸田真史;Toru Hisabori;Ei-ichiro Sunamura;Imashimizu Mari;砂村栄一郎
• 通讯作者: 砂村栄一郎

Regulation of FoF1-ATPase from Synechocystis sp.PCC 6803 by the γ and ε subunits is significant for light/dark adaptation

γ 和 ε 亚基对集胞藻 PCC 6803 的 FoF1-ATPase 的调节对于光/暗适应具有重要意义

• 发表时间: 2011
• 期刊: J.Biol.Chem.
• 作者: Kenichiro Shiraya;Akihiko Takahashi;Masashi Toda;戸田真史;Toru Hisabori;Ei-ichiro Sunamura;Imashimizu Mari
• 通讯作者: Imashimizu Mari