Ras-PI3Kシグナルによるエンドサイトーシスとウイルス感染制御機構の解明

Ras-PI3K信号阐明内吞作用和病毒感染控制机制

基本信息

批准号：
11J04616
负责人：
藤岡容一朗
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

项目摘要

我々はこれまでにRasの標的因子であるPI3Kのエンドゾーム移行がエンドサイトーシスを制御することを明らかとしており、インフルエンザをはじめとする複数種のウイルスは宿主細胞のRas-PI3Kシグナル活性化を介してエンドサイトーシスを促進し、この亢進したエンドサイトーシスに便乗して巧妙に侵入することを報告している。昨年度までに、"PI3Kに特徴的な配列に結合する因子が、Ras-PI3K複合体の局在制御を介してエンドサイトーシスによる物質取り込みやウイルスの宿主細胞侵入に関与する"という仮説のもと、この配列を欠損したPI3KのRas結合領域とRasの複合体の細胞内挙動を追跡したところ、増殖因子刺激依存的なエンドゾームへの移行は見られずゴルジ装置付近に蓄積した。また、上記アミノ酸配列にエピトープタグもしくは蛍光タンパク質を融合して培養細胞に発現させたところ、エンドサイトーシスとウイルス感染が抑制された。以上から、上記仮説を支持するデータが得られており、本年度は、この配列に結合する因子を北海道大学大学院生命科学院小布施力史教授との共同研究によりMS/MS解析を用いて網羅的に探索した。その結果、ユビキチン化関連タンパク質、細胞骨格関連タンパク質をはじめとする、40個の候補因子が同定された。それら因子をクローニングし、免疫沈降法を用いてPI3Kとの相互作用を検討した。PI3Kとの結合が確認された因子に対して、蛍光タンパク質を融合し培養細胞に発現させ、蛍光顕微鏡による観察を行ったところ、エンドゾームへの局在が確認された因子を特定した。以上の結果から、特定された因子は上記の仮説に関与することが示唆され、現在はRNA干渉を用いた発現抑制を行い、Ras-PI3Kのエンドゾーム移行、およびエンドサイトーシスへの関与を検討している。最終的には、エンドサイトーシスの緻密な制御機構の解明につなげたい。

我们以前曾透露，靶向RAS PI3K的内体迁移调节内吞作用，并报告说，包括流感在内的多种病毒通过宿主细胞中的Ras-PI3K信号激活促进内吞作用，并巧妙地侵入了这种增强的内吞作用。直到去年，基于以下假设：“与PI3K结合的因素与内吞作用诱导的摄取和病毒宿主细胞通过对Ras-PI3K复合物的定位控制进行侵入和病毒宿主细胞的侵袭有关”，我们跟踪了Ras结合区域和Ras ras ras sequient and sequence and timention的细胞内行为，这些序列不存在，这些序列是刺激效果，这些序列是刺激效果，并发现了效果。并在高尔基斯装置附近发现了积累。此外，当将氨基酸序列与表位标签或荧光蛋白融合并在培养的细胞中表达时，抑制了内吞作用和病毒感染。从以上，已经获得了支持上述假设的数据，并且在今年，使用MS/MS分析与北海道大学生命科学研究生院Obuse Rikishi教授合作，使用MS/MS分析全面探索了与该顺序结合的因素。结果，确定了40个候选因素，包括泛素化相关的蛋白质和细胞骨架相关蛋白。克隆这些因素，并使用免疫沉淀研究了它们与PI3K的相互作用。已确认与PI3K结合的因素被融合为在培养细胞中表达荧光蛋白，并通过荧光显微镜观察到，已确认已确认将其定位于内体的因子。上述结果表明，确定的因素与上述假设有关，目前正在使用RNA干扰研究表达抑制，并参与RAS-PI3K的内体迁移和内吞作用。最终，我们想帮助阐明内吞作用的精确控制机制。