部位特異的蛍光色素導入法に基づいた新規タンパク質分子間相互作用システムの開発

基于位点特异性荧光染料引入方法开发新型蛋白质分子间相互作用体系

• 批准号: 16750063
• 负责人: 末田 慎二
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kyushu Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16750063/
• 关键词: タンパク質間相互作用解析; タンパク質蛍光標識化; ランタノイド金属イオン; 時間分解蛍光分析; 蛍光エネルギー移動; タンパク相互作用解析; 希土類金属イオン

タンパク質間相互作用解析システムへ適用可能なタンパク質の部位特異的な蛍光標識化法の開発を行った。本研究ではアスパラギン酸残基を複数含む10数量体程度のペプチドを分析対象のタンパク質の末端へ導入し、ランタノイド金属イオンと錯形成させる。この際、ペプチド配列中にトリプトファン残基を導入し、トリプトファン残基からのエネルギー移動によりテルビウムイオンを発光させることが可能である。一方で、外部から光増感剤としてβジケトン配位子を添加すると、ユウロピウムイオンを発光させることが可能である。今年度はアスパラギン酸残基とトリプトファン残基を組み合わせた15量体のペプチド配列を、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパクとして発現させ、その発光挙動を検討した。この融合タンパクへテルビウム金属イオンを添加したところ、トリプトファンの光励起に基づき、テルビウム金属イオンの遅延蛍光が確認できた。その金属錯体の安定性は極めて高く、解離定数は少なくとも1nM以下であり、その発光強度もCy5と同等かそれ以上であることがわかった。また、グルタチオンプレートを利用して、ペプチド配列を有するGSTを固相担体上に固定化し、その発光挙動を検討した。その結果、GSTの添加量に応じて発光強度が増大し、少なくとも100pmolのタンパクが存在すれば検出可能であるということがわかった。一方で、ユウロピウム金属イオンと錯形成させ、βジケトンを添加し、そのβジケトンからのエネルギー移動に基づいた蛍光測定も試みた。予想通りβジケトン添加に伴い、ユウロピウムイオンの発光が確認できた。また固相担体上では、GSTのみのコントロールとの間に明瞭な差が見られ、タンパク質の蛍光標識化法として活用できることを示すことができた。

我们开发了一种蛋白质位点特异性荧光标记方法，可应用于蛋白质-蛋白质相互作用分析系统。在本研究中，我们将含有多个天冬氨酸残基的十肽引入到待分析蛋白质的末端，并与镧系金属离子形成复合物。此时，可以将色氨酸残基引入肽序列中，并且由于来自色氨酸残基的能量转移而导致铽离子发光。另一方面，当外部添加β-二酮配体作为光敏剂时，可以使铕离子发光。今年，我们表达了一种 15 聚体肽序列，该序列将天冬氨酸和色氨酸残基结合为与谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 的融合蛋白，并研究了其发光行为。当将铽金属离子添加到该融合蛋白中时，基于色氨酸的光激发观察到铽金属离子的延迟荧光。结果发现，该金属配合物的稳定性极高，解离常数至少为1nM或更小，其发射强度等于或高于Cy5。此外，使用谷胱甘肽板，将具有肽序列的GST固定在固体支持物上，并研究其发光行为。结果发现，发光强度根据GST添加量而增加，并且如果存在至少100pmol的蛋白质，则可以检测到。另一方面，我们还尝试了通过将β-二酮与铕金属离子络合并添加β-二酮来进行基于β-二酮的能量转移的荧光测量。正如预期的那样，通过添加β-二酮证实了铕离子的发射。此外，在固相支持物上，仅 GST 对照和结果之间存在明显差异，表明它可以用作荧光标记蛋白质的方法。