細胞内情報伝達分子の活性化の時間制御機構の解明とその薬剤開発への応用

细胞内信号分子激活时间控制机制的阐明及其在药物开发中的应用

基本信息

批准号：
05J03901
负责人：
高橋英之
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J03901/
关键词：
プロテインキナーゼC 脊髄小脳変性症脊髄小脳失調症

项目摘要

優性遺伝性脊髄小脳変性症14型(SCA14)の原因である変異proteinkinase Cγ(PKCγ)は培養細胞に一過性に発現させるとユビキチン陽性の細胞内凝集体を形成して細胞毒性を示す。しかしながらこの変異PKCγの凝集体形成機序は現在明らかになっていない。一昨年度研究代表者はこの凝集体形成にPKCγのC1Aドメインとキナーゼドメインが関与している可能性があることを示した。昨年度においては、さらに実際に変異PKCγ同士で結合する可能性のあるドメインを明らかにするため、各ドメインを用いた共免疫沈降実験を行なった。その結果、C1Aドメイン同士、キナーゼドメイン同士、C1Aドメインとキナーゼドメインが実際に結合することが明らかとなり、変異PKCγの凝集体形成においてこれらのドメイン間結合が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。次に研究代表者は変異PKCγのユビキチン化に関与するタンパク質について検討した。carboxy terminus Hsc70 interacting protein(CHIP)はHsp70に結合するE3ユビキチンリガーゼとして知られている。PKCはHsp70と結合することが報告されていたため、変異PKCγのE3ユビキチンリガーゼの候補としてCHIPに着目し、始めにPKCγとCHIPが結合するかどうかを共免疫沈降実験にて検討した。その結果、変異PKCγのみならず野生型PKCγもCHIPと結合することが明らかとなった。次にCHIPを強発現させると予想通り野生型PKCγのユビキチン化の増強が見られた。以上の結果、CHIPがPKCγのE3ユビキチンリガーゼとして働いている可能性が示唆された。

突变蛋白激酶 Cγ (PKCγ) 可导致显性脊髓小脑共济失调 14 型 (SCA14)，在培养细胞中瞬时表达时，通过形成泛素阳性细胞内聚集物而表现出细胞毒性。然而，该突变体PKCγ聚集体形成的机制目前尚不清楚。两年前，主要研究者表明，PKCγ 的 C1A 结构域和激酶结构域可能参与了这种聚集体的形成。去年，我们使用每个结构域进行了免疫共沉淀实验，以进一步阐明突变体 PKCγ 之间实际上可能相互结合的结构域。结果表明，C1A结构域实际上彼此结合，激酶结构域彼此结合，C1A结构域和激酶结构域实际上结合，这表明这些结构域之间的结合可能在突变体的形成中发挥重要作用。 PKCγ 聚集体。接下来，主要研究人员研究了参与突变体 PKCγ 泛素化的蛋白质。羧基末端 Hsc70 相互作用蛋白 (CHIP) 被称为 E3 泛素连接酶，可与 Hsp70 结合。由于已有报道 PKC 与 Hsp70 结合，我们将 CHIP 作为突变体 PKCγ 的 E3 泛素连接酶的候选者，并首先通过免疫共沉淀实验研究了 PKCγ 和 CHIP 是否结合。结果表明，不仅突变型PKCγ而且野生型PKCγ也与CHIP结合。接下来，当 CHIP 强烈表达时，正如预期的那样，野生型 PKCγ 的泛素化增强。上述结果表明CHIP可能作为PKCγ的E3泛素连接酶发挥作用。