分裂酵母におけるRad51依存的な遺伝的組換え反応の分子機構

裂殖酵母Rad51依赖性基因重组反应的分子机制

基本信息

批准号：
05J03468
负责人：
高橋奈美 (春田奈美)
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Osaka University (2006-2007)Yokohama City University (2005)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J03468/
关键词：
DNA修復 Rad51 Rad55 Rad57 相同組換え分裂酵母 Sfr1 Swi5 DNA修複生化学

项目摘要

分裂酵母における相同組換え反応のメカニズムを解明するために、Rad51のアクセサリータンパク質であるSwi5-SfrlとRad55-Rad57の複合体について解析を行った。相同組換えの中心的な役割を果たすRad51は、DNA鎖交換反応を行う。Sfrl/Swi5複合体の存在下では、Rad51タンパク質のATP加水分解活性および鎖交換反応活性が顕著に促進されることを、試験管内再構成による反応系でこれまで示してきた。本年度はRad51のもう一つのアクセサリータンパク質であるRad55-Rad57に焦点をあてて研究を進めた。Rad55,Rad57は単独での発現および大腸菌での発現は、不溶性画分になったが、昆虫細胞において共発現することで可溶性になった。そこで、数段階のクロマトグラフィーを組み合わせて複合体として精製することができた。精製したタンパク質複合体は、免疫沈降法によってRad51と物理的な相互作用があることを示した。しかし、予想されたATP加水分解活性やDNA結合活性は認められなかった。この精製したRad55-Rad57をRad51のDNA鎖交換反応に加えたが、反応の顕著な促進は見られなかった。しかし、Swi5-Sfrl存在下でのRad51の反応は、Swi5-Sfrlの等量のRad55-Rad57によって阻害を受けたことから、二つのアクセサリータンパク質が拮抗してRad51に働いている可能性も示唆された。

为了阐明裂殖酵母中同源重组反应的机制，我们分析了Rad51的辅助蛋白Swi5-Sfrl和Rad55-Rad57的复合物。 Rad51 在同源重组中发挥核心作用，负责执行 DNA 链交换反应。我们之前已经在体外重建反应体系中证明，在Sfrl/Swi5复合物的存在下，Rad51蛋白的ATP水解活性和链交换反应活性得到显着促进。今年，我们的研究重点是Rad55-Rad57，Rad51的另一种辅助蛋白。当Rad55和Rad57单独表达或在大肠杆菌中表达时，它们变成不溶性级分，但当在昆虫细胞中共表达时它们变得可溶。因此，我们能够通过组合几个色谱步骤将复合物纯化为复合物。通过免疫沉淀显示纯化的蛋白质复合物与 Rad51 发生物理相互作用。然而，没有观察到预期的 ATP 水解活性和 DNA 结合活性。当将该纯化的Rad55-Rad57添加到Rad51 DNA链交换反应中时，没有观察到反应的显着加速。然而，在 Swi5-Sfrl 存在的情况下，Rad51 反应受到与 Swi5-Sfrl 相同量的 Rad55-Rad57 的抑制，表明这两种辅助蛋白可能对 Ta 产生拮抗作用。